揭秘 GAF 结构域功能：远离配体结合位点的共进化残基的关键作用

本文通过统计耦合分析（SCA）、分子动力学（MD）模拟等方法，研究发现 GAF 结构域中 L267 和 F295 这两个远离配体结合位点的共进化残基，对其功能至关重要，为理解蛋白质别构调节机制及相关疾病研究提供了新视角。

　　

引言

在生命活动的复杂调控网络中，蛋白质的活性精细调控起着关键作用。许多蛋白质的活性由相关调节结构域控制，这些调节结构域往往通过结合小分子配体，并将结构变化传递给催化结构域来发挥功能。GAF 结构域（cGMP 特异性 PDEs、细菌腺苷酸环化酶和细菌 FhLA 转录调节因子）是一类重要的调节结构域家族，广泛存在于从古细菌到包括人类在内的脊索动物等多种生物中，在众多生物学过程里扮演着不可或缺的角色，如细菌的基因表达调控、植物和蓝藻的光检测与信号传导、植物的乙烯检测与信号传导、细菌的固氮作用、蓝藻腺苷酸环化酶的 cAMP 结合反馈控制、细菌和植物的双组分传感器组氨酸激酶调节，以及哺乳动物环核苷酸磷酸二酯酶（PDEs）的功能调节等。

以 PDE5 中的 cGMP 结合 GAFa 结构域为例，它在人体多个组织中参与调节 cGMP 水平，像血管平滑肌细胞、肺、脑、肾、心肌细胞、胃肠道组织、血小板和阴茎海绵体等。当 GAFa 结构域结合 cGMP 后，会诱导自身构象发生变化，并将这种变化传递给 C 端的 cGMP 水解催化结构域，进而激活其水解活性，加速 cGMP 的水解。然而，尽管对 GAF 结构域的研究已取得一定进展，但 cNMP 结合 GAF 结构域诱导的别构通讯过程仍存在诸多未知，尤其是参与该过程的氨基酸残基身份及其作用机制尚不明确。

本研究综合运用基于蛋白质序列的共进化分析、分子动力学（MD）模拟和生物物理检测等方法，深入探究 GAF 结构域的配体结合和别构调节机制。研究人员通过统计耦合分析（SCA）筛选出可能在配体结合和调节功能中发挥作用的共进化残基，随后利用 MD 模拟和生物物理检测等手段，详细研究这些残基在 GAF 结构域别构调节中的具体作用。

结果

1. 利用 SCA 鉴定 GAF 结构域中的共进化残基：研究人员运用 SCA 方法对 GAF 结构域序列进行分析。SCA 通过分析多序列比对中氨基酸位置对之间的协变情况，来识别蛋白质家族中的共进化残基。研究人员从 Pfam 数据库获取 GAF 结构域序列并进行优化，运用特定算法进行 SCA 分析，生成残基对的相关分数矩阵。结果显示，仅约 1% 的残基对相关分数大于 0.25，通过层次聚类分析发现了 9 个高度共进化的残基位置。

研究人员将这些共进化残基定位到 PDE5 的 GAFa 结构域（氨基酸残基 164 - 312；人类 PDE5A1 编号；PDB: 2K31）的 cGMP 结合结构上。之所以选择 PDE5 的 GAFa 结构域，是因为它具有明确的功能，即高特异性和高亲和力结合 cGMP，并别构激活 PDE5 催化结构域的 cGMP 水解活性，且其三维结构在无 cGMP（未结合配体；apo）和结合 cGMP（结合配体；holo）状态下均已明确，同时研究人员之前已构建了基于 BRET 的该结构域和全长 PDE5 的构象生物传感器，便于后续研究。

在这 9 个共进化残基中，6 个位于或靠近 GAFa 结构域的配体结合位点，而 S289、L267 和 F295 这 3 个残基远离结合位点，其中 L267 和 F295 的耦合分数较高，且二者形成疏水相互作用。因此，研究人员选择进一步对 L267 和 F295 这两个残基进行深入研究。2. MD 模拟揭示 PDE5 GAFa 结构域在突变后的结构动力学变化：为了探究 L267 和 F295 这两个高度共进化残基突变后的影响，研究人员构建了 L267A 和 F295A 突变的 apo 和 holo 结构模型，并对野生型（WT）和突变型 GAFa 结构域进行了 3 次独立的、时长 1000 ns 的全原子、显式溶剂 MD 模拟。

通过对 MD 模拟轨迹的详细分析，研究人员发现 WT 的 apo 和 holo 形式的 GAFa 结构域在结构动力学上存在明显差异，突变型与 WT 之间也有显著不同。例如，通过均方根偏差（RMSD）测量发现，cGMP 结合的 GAFa 结构域的 RMSD 值低于 apo 形式，而 L267A 突变的 apo 形式 RMSD 值降低，F295A 突变的 apo 形式 RMSD 值升高。此外，通过均方根波动（RMSF）分析发现，形成结构域环区域的残基波动较高，且 L267A 突变使 apo 形式中靠近 cGMP 结合位点的 β2/β3 环的波动降低，而 F295A 突变则无此现象。

在测量蛋白质整体结构变化的回转半径（Rg）时，研究人员发现 holo WT GAFa 结构域的 Rg 小于 apo 形式，apo L267A 突变体的 Rg 也小于 apo WT，而 holo F295A 突变体的 Rg 大于 holo WT。同时，测量 L267 和 F295 两个残基位置的质心距离发现，F295A 突变破坏了二者之间的疏水相互作用，导致距离增大且波动增加。

这些结果表明，apo WT GAFa 结构域更具动态性，结合 cGMP 后转变为更紧凑的结构。L267A 突变使 apo GAFa 结构域更紧凑，可能影响 cGMP 结合；F295A 突变破坏疏水相互作用，增加结构域的动力学，降低其紧凑性，影响配体结合和 cGMP 结合诱导的构象变化。

进一步研究发现，L267A 和 F295A 突变的 holo GAFa 结构域中 cGMP 的溶剂可及表面积（SASA）显著增加，表明配体在突变体结合口袋中的埋藏程度降低。同时，突变体中 cGMP 与 GAFa 结构域的相互作用能量（范德华力和静电相互作用）和氢键数量减少，说明突变对配体与结合位点的相互作用产生负面影响。

通过动态交叉相关（DCC）分析，研究人员发现 L267A 和 F295A 突变体中，两个共进化位置与特定区域之间的动态交叉相关运动减少，这可能影响配体结合。3. L267A 和 F295A 突变对 PDE5 GAFa 结构域构象变化及 cGMP 结合的影响：基于 MD 模拟观察到的结构动力学变化，研究人员通过实验进一步探究 L267A 和 F295A 突变的影响。PDE5 GAFa 结构域结合 cGMP 后会发生构象变化，研究人员利用之前构建的基于 BRET 的 GAFa 结构域生物传感器，通过监测 BRET 效率的变化来检测 cGMP 结合诱导的构象变化。

研究人员构建了 L267A 和 F295A 突变的生物传感器质粒，并通过 Western blot 分析确认了生物传感器的表达。生物发光光谱测定结果显示，WT GAFa 结构域生物传感器存在显著的共振能量转移，而突变体的能量转移减少，且突变体的基础 BRET 比率显著降低，表明突变导致 GAFa 结构域发生构象变化。

在 cGMP 结合实验中，WT GAFa 结构域生物传感器在 1 μM cGMP 存在下 BRET 增加，而 L267A 和 F295A 突变体则无明显变化。通过剂量 - 响应实验发现，WT 生物传感器的 cGMP 浓度依赖性 BRET 增加，EC₅₀值为 19 ± 13 nM，而 L267A 和 F295A 突变体需要更高浓度的 cGMP 才能产生类似的 BRET 增加，其 EC₅₀值分别约为 110 ± 74 μM 和 194 ± 71 μM，这表明突变降低了 GAFa 结构域对 cGMP 的亲和力。

此外，研究人员还研究了突变对 GAFa 结构域热稳定性的影响。利用热稳定的荧光蛋白 mNeonGreen 和 NLuc 构建生物传感器，通过测量不同温度下的 BRET 变化，发现 L267A 和 F295A 突变导致 GAFa 结构域的热稳定性略有下降，但这种下降不太可能是导致基础 BRET 降低和 cGMP 结合诱导构象变化的 EC₅₀升高的原因，更可能是由于构象和结构动力学的改变。4. L267A 和 F295A 突变对全长 PDE5A2 构象变化及 cGMP 结合的影响：研究人员在之前构建的基于 BRET 的全长 PDE5A2 生物传感器中引入 L267A 和 F295A 突变，以研究其对全长 PDE5 中 cGMP 结合诱导构象变化的影响。Western blot 分析显示 WT 和突变体生物传感器构建体表达相似。生物发光光谱分析表明，突变体的共振能量转移减少，基础 BRET 显著降低，说明突变导致蛋白质构象改变。

剂量 - 响应实验结果显示，突变体的最大 BRET 变化减小，剂量 - 响应曲线右移，L267A 和 F295A 突变体的 EC₅₀值分别为 181 ± 30 nM 和 3.4 ± 2.1 μM，均高于 WT 的 73 ± 20 nM，这表明突变导致 GAFa 结构域在全长 PDE5A2 中的构象改变和 cGMP 亲和力显著降低，且 F295A 突变的影响更为显著。

研究人员还比较了孤立 GAFa 结构域和全长 PDE5A2 中 cGMP 结合诱导构象变化的 EC₅₀值与 MD 模拟得到的 cGMP 结合自由能变化，发现 L267A 和 F295A 突变体中 cGMP 结合自由能变化普遍降低，且在全长 PDE5A2 中，额外结构域对 GAFa 结构域的 cGMP 诱导构象变化有影响。此外，多序列比对和数据库分析表明，这两个共进化残基在人类环核苷酸结合 PDEs 中高度保守，其变异可能对 PDE5A2 的功能产生有害影响。5. 突变荧光 GAF 结构域蛋白 miRFP670nano3 中的共进化残基对其荧光的影响：为了探究 L267 和 F295 这两个残基在 GAF 结构域功能中的普遍适用性，研究人员分析了多种 GAF 结构域的结构，发现这两个残基在不同结构域中位置相近且远离配体结合位点，暗示其功能的保守性。

研究人员利用一种源自蓝藻视紫红质光受体 GAF 结构域的近红外荧光蛋白 miRFP670nano3 进行研究，构建了其 WT 和 L100A、W125A 突变体（分别相当于 PDE5 GAFa 结构域中的 L267A 和 F295A 突变）。在 HEK293T 细胞中表达这些蛋白后，通过 Western blot 分析确认表达相似，荧光测量结果显示，L100A 和 W125A 突变体的荧光显著降低，表明这两个共进化残基对 miRFP670nano3 GAF 结构域结合其配体胆绿素至关重要，进而证实了它们在 GAF 结构域功能中的重要性。6. cGMP 诱导 PDE5 GAFa 结构域别构激活的机制：研究人员通过分析 apo 和 holo 形式的 WT 和突变体 GAFa 结构域的 MD 模拟轨迹，深入探究 cGMP 结合诱导的构象变化机制以及突变对该机制的影响。研究人员测量了围绕 cGMP 结合位点的 β3 和 α4 之间的距离，以及位于结构域 N 端和 C 端的 α2 和 α5 之间的距离。

结果发现，cGMP 结合 WT GAFa 结构域导致 β3 - α4 和 α2 - α5 距离减小，即 cGMP 结合位点 “盖子” 关闭，N 端和 C 端 α - 螺旋靠近，这与 WT GAFa 结构域生物传感器在 cGMP 存在下 BRET 增加的现象一致。在 apo L267A 突变体中，β3 - α4 和 α2 - α5 距离密度中心与 WT 相似；而在 holo L267A 突变体中，α2 - α5 距离密度中心减小，但 β3 - α4 距离密度中心增加，表明 L267A 突变导致 cGMP 结合位点 “盖子” 打开，可能增强 cGMP 从蛋白质上的解离，从而增加 cGMP 结合的 EC₅₀。

在 apo F295A 突变体中，β3 - α4 和 α2 - α5 距离出现两个密度中心，表明突变在 apo 状态下影响了 cGMP 结合位点 “盖子” 和末端螺旋的稳定性；在 holo 状态下，F295A 突变体的 β3 - α4 距离与 WT holo 状态相似，但 α2 - α5 距离与 apo 状态的主要中心相似，且失去了 apo 状态下的第二个中心，这表明 cGMP 结合 F295A 突变体可能无法有效传递别构信号，与 GAFa 生物传感器测定的 cGMP 结合诱导构象变化的 EC₅₀增加结果相符。

讨论

GAF 结构域作为广泛存在且高度保守的分子开关，在众多生物过程中发挥着关键作用。本研究运用 SCA 成功鉴定出 GAF 结构域中高度共进化的残基位置，其中 L267 和 F295 这两个远离配体结合位点的残基引起了研究人员的关注。通过对 PDE5 的 GAFa 结构域进行深入的计算机模拟和体外实验，研究人员揭示了这两个残基在配体结合诱导构象变化中的重要作用。

L267A 突变导致 GAFa 结构域的结构变化，使其在实验中表现为 BRET 降低。结构动力学分析表明，该突变降低了结构域的动力学，使 apo 状态转变为更紧凑的形式，这可能影响配体结合，因为 apo 形式的结构灵活性对配体结合至关重要。此外，L267A 突变在 holo 形式下导致 cGMP 结合位点 “盖子” 打开，使配体难以保留在结合位点内，MD 模拟显示该突变增加了配体 SASA，减少了相互作用能量、氢键形成和结合自由能，实验中 L267A 突变的 BRET - 基于 GAFa 结构域生物传感器的 cGMP 结合诱导构象变化的 EC₅₀比 WT 增加了 5000 多倍。

F295A 突变同样诱导了 GAFa 结构域的结构变化，实验中表现为基础 BRET 比率降低。MD 模拟轨迹分析显示，该突变破坏了与相邻残基的相互作用，导致结构域动力学增加，holo 形式下结构更松散。具体而言，F295A 突变增加了 holo 形式下 α2 - α5 的距离，干扰了配体结合后的别构信号传递。实验中，F295A 突变的 BRET - 基于 GAFa 结构域生物传感器的 cGMP 结合诱导构象变化的 EC₅₀比 WT 增加了 10000 多倍。

这两个突变均对孤立 GAFa 结构域中 cGMP 结合诱导的构象变化产生负面影响。L267A 突变主要影响配体结合，降低 apo 形式的灵活性，增加 holo 形式下配体解离的可能性；F295A 突变则通过破坏局部疏水相互作用，既影响配体在结合口袋中的稳定性，又干扰别构信号传递。

在全长 PDE5 中，这两个突变同样导致基础 BRET 比率降低，最大 BRET 变化值减小，cGMP 结合诱导的构象变化显著减少，EC₅₀值增加，表明它们在全长 PDE5 的 GAFa 结构域别构功能中起着重要作用，且 F295A 突变对全长 PDE5 的影响更为显著。此外，研究人员发现这两个残基在其他 GAF 结构域中也具有重要功能，如在 miRFP670nano3 中突变这两个残基会导致荧光发射下降，可能是由于胆绿素结合减少。

先前对 PDE2A 和 PDE6 的研究揭示了 GAF 结构域介导的 PDE 催化结构域调节机制，但本研究发现了参与 cGMP 结合诱导构象变化的额外共进化氨基酸残基，这些残基不仅远离 cGMP 结合位点，而且与 GAFb 结构域无界面相互作用，表明环核苷酸结合 PDEs 中的别构信号传递机制比之前认为的更为复杂和多模式。

研究人员还发现，这两个共进化残基在人类环核苷酸结合 PDEs 的 GAFa 和 GAFb 结构域中高度保守，gnomAD 数据库中这些位置的突变被预测对相关 PDE 基因有害，进一步证明了它们在 GAF 结构域功能中的关键作用。F295 是区分环核苷酸结合 GAF 结构域与其他 GAF 结构域的 NKFDE 基序的一部分，尽管该基序中的残基不直接与环核苷酸配体接触，但对稳定 GAF 结构域折叠、环核苷酸结合和别构信号传递至关重要，本研究进一步明确了 F295 在<