Intronic RNAscope 探针：精准识别心肌细胞核与细胞周期活动的新利器

在心脏再生研究中，准确识别心肌细胞（CM）核颇具挑战。研究人员开展了利用 Intronic RNAscope 探针识别 CM 核及研究其细胞周期活动的研究。结果显示该探针特异性强、效率高，有助于深入研究心脏再生机制，为相关疾病治疗提供新方向。

　　在心脏的奇妙世界里，心肌细胞（Cardiomyocyte，CM）就像一群勤劳的 “小工匠”，维持着心脏的正常跳动。然而，当心脏遭遇心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）等伤病时，这些 “小工匠” 的修复和再生能力却成了科学家们关注的焦点。要研究 CM 的再生，准确识别 CM 核至关重要，可传统方法却困难重重。比如，用抗体标记肌节蛋白来识别 CM 核时，由于成年心脏中 CM 核只占总核数的 20 - 30%，且常与间质核相邻，导致识别的敏感性和特异性不高，分别只有 43% 和 89% ，即便结合小麦胚芽凝集素（WGA）染色，也仅提升到 65% 和 97%。而使用内源性核标记物抗体，像 Nkx2.5、Gata4、Mef2c 和 PCM1 等，又存在特异性和信号强度的问题，部分标记物在有丝分裂时还难以观察。利用转基因小鼠模型虽然能标记 CM 核，但存在成本高、遗传操作可能引发心脏表型改变等弊端。

为了解开这些难题，来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了关于 Intronic RNAscope 探针的研究，旨在利用该探针精准识别 CM 核，并探究 CM 的细胞周期活动。研究发现，Intronic RNAscope 探针能够高效、准确地标记 CM 核，即使在有丝分裂过程中核膜破裂时，也能与 CM 染色质紧密结合，实现对 CM 核的持续识别。这一研究成果意义重大，它为心脏再生研究提供了有力的工具，有助于更深入地了解 CM 的增殖机制，为心肌梗死等心脏疾病的治疗带来了新的希望。该研究成果发表在《Communications Biology》杂志上。

研究人员在此次研究中，主要运用了以下几种关键技术方法：首先是构建多种动物模型，如 FVB/NJ、Obscurin - H2B^GFP、Fucci2a 和 XMLC2 - Cre 小鼠模型，并通过 PCR 进行基因分型。其次是组织学处理，对胚胎或成年心脏进行解剖、固定、蔗糖饱和处理后冷冻切片。然后是 RNAscope 荧光原位杂交（RNAscope fluorescent in situ hybridization，RNAscope FISH）技术，用于检测特定 RNA 的表达。最后利用共聚焦显微镜进行成像和分析。

研究结果主要有以下几个方面：

• Tnnt2 内含子 RNAscope 探针高效特异性标记成年 CM 核：研究人员使用 Obscn^GFP/GFP报告小鼠，对 Tnnt2 内含子 RNAscope 探针进行测试。结果显示，该探针与 Obscurin - H2B^GFP信号高度共定位，超过 95% 的 CM 核被双标记，且在心脏不同区域无显著差异。而正常外显子 Tnnt2 RNAscope 探针则难以区分 CM 核和间质核。这表明 Tnnt2 内含子 RNAscope 探针能高效准确地标记 CM 核。
• 在胚胎心脏中，Tnnt2 内含子 RNAscope 探针可识别 CM 核，包括有丝分裂过程：通过给怀孕的 FVB/NJ 母鼠注射 EdU，研究发现 Tnnt2 内含子 RNAscope 探针能够标记经历 DNA 合成的胚胎 CM 核。进一步研究发现，在有丝分裂的各个阶段，包括核膜破裂后的中期和后期，该探针都能与 CM 染色质保持共定位。利用 Fucci2a 小鼠模型进一步证实，Tnnt2 内含子 RNA 在有丝分裂各阶段都能准确标记 CM 核 / 染色质。
• 在成年心脏中，Tnnt2 内含子 RNAscope 探针揭示 MI 后 CM 的 EdU 掺入动态，但未发现 CM 有丝分裂的证据：研究人员对 8 周龄 FVB/NJ 雄性小鼠进行左前降支（LAD）结扎手术，模拟心肌梗死。通过不同时间点注射 EdU 并结合 Tnnt2 内含子 RNAscope 探针检测，发现 MI 后 BZ 和 IZ 区域的 CM 核有 EdU 掺入，且掺入动态相似。在 MI 后 12 - 15 天，EdU 掺入频率最高，之后逐渐下降。然而，在检测有丝分裂相关指标时，很少观察到 Tnnt2 内含子 RNA 与 pH3 的共定位，几乎没有证据表明 CM 发生有丝分裂。
• Intronic RNAscope 探针 Myl2 和 Myl4 分别特异性标记心室和心房 CM：基于 Myosin light chain 2（Myl2）和 Myosin light chain 4（Myl4）在心室和心房的特异性表达，研究人员设计了相应的 Intronic RNAscope 探针。实验表明，Myl2 内含子 RNAscope 探针在心室 CM 中特异性表达，Myl4 内含子 RNAscope 探针在心房 CM 中特异性表达，且二者与 Obscurin - H2B^GFP都有高度共定位，超过 95% 的相应 CM 核被双标记，证明这两种探针能高效特异性地标记心室和心房 CM。

研究结论和讨论部分指出，Intronic RNAscope 探针克服了传统方法的诸多缺点，具有与肌节蛋白相同的 CM 特异性，且能实现核定位。它可有效标记有丝分裂过程中的 CM 核或染色质，避免了基因操作带来的潜在副作用。此外，通过对 EdU 掺入动态的研究，为其他研究人员确定 MI 后 EdU 给药时间提供了有价值的参考。在设计 Intronic RNAscope 探针时，要确保足够数量的 ZZ 对和合适的靶序列长度，以保证信号强度和特异性。总体而言，Intronic RNAscope 探针在心脏科学领域具有巨大的应用价值和潜力，有望推动心脏再生研究的进一步发展，为心脏疾病的治疗开辟新的道路。