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为探究 ME2 乳酸化的功能意义及调控机制，江南大学附属医院等研究人员开展了关于 ME2 K352 乳酸化对酶活性、氧化还原平衡和肿瘤进展影响的研究。结果发现 SIRT3 介导的 ME2 K352 去乳酸化破坏氧化还原平衡、抑制肿瘤生长。该研究为癌症治疗提供新策略。
在癌症的神秘世界里，癌细胞就像一群失控的 “小怪兽”，它们的代谢方式和正常细胞大不相同。癌细胞偏好有氧糖酵解，即便氧气充足，也不选择高效的氧化磷酸化，这种被称为 “瓦尔堡效应（Warburg effect）” 的现象，是癌细胞快速增殖和存活的关键。苹果酸酶 2（ME2）作为三羧酸循环（TCA cycle）中的关键酶，在维持细胞氧化还原平衡和支持肿瘤代谢方面发挥着重要作用。然而，ME2 乳酸化的功能意义以及调控它的机制，就像隐藏在迷雾中的宝藏，一直未被人们完全揭开。
为了探索这些未知，江南大学附属医院和江南大学无锡医学院癌症表观遗传学实验室的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cellular Oncology》杂志上，为我们理解肿瘤代谢和癌症治疗带来了新的曙光。
研究人员采用了多种关键技术方法来开展这项研究。在细胞实验方面，他们培养了人胚肾 293T（HEK293T）和 HCT116 细胞，通过免疫沉淀（IP）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术，来评估 ME2 乳酸化水平以及它与 Sirtuin 3（SIRT3）的相互作用；利用质谱分析来确定 ME2 上的乳酸化位点。在细胞功能检测上，通过测量 NADH 生成量来评估 ME2 的酶活性，使用相关试剂盒检测细胞内 NADP+/NADPH 比值、代谢中间产物和 ATP 水平，以此探究 ME2 K352 乳酸化对细胞代谢的影响。此外，还运用了细胞增殖实验（CCK-8 和集落形成实验）来评估细胞的增殖能力。在动物实验方面，构建了裸鼠异种移植瘤模型，通过将稳定表达 ME2（野生型 WT 和 K352R 突变体）的 HCT116 细胞皮下注射到裸鼠体内，观察肿瘤生长情况，并进行 Ki-67 免疫组化染色来评估肿瘤细胞的增殖活性。
下面来看看具体的研究结果：
- ME2 可以发生乳酸化：研究人员发现，乳酸能够促进 ME2 的乳酸化。用乳酸钠处理表达 Flag 标记的 ME2 的 HEK293T 细胞后，通过 IP 和免疫印迹实验证实，ME2 的乳酸化水平显著增加。在生理条件下，内源性 IP 结果也证明了 ME2 乳酸化的存在。而且，ME2 的乳酸化呈现剂量依赖性，随着乳酸钠浓度的增加，乳酸化水平也随之升高。通过药物调节乳酸生成，发现抑制乳酸脱氢酶（LDH）的奥昔胺酸（oxamate）可显著降低 ME2 乳酸化，而抑制线粒体氧化磷酸化的鱼藤酮则增强 ME2 乳酸化。免疫荧光分析进一步证实了在结直肠癌细胞中，乳酸化与 ME2 共定位。
- ME2 在 K352 位点发生乳酸化：通过对纯化的乳酸化 ME2 蛋白进行质谱分析，研究人员确定了 K352 是 ME2 上潜在的乳酸化位点。构建 K352R（模拟去乳酸化状态）和 K352Q（模拟带负电荷的乳酸化赖氨酸）定点突变体并在 HEK293T 细胞中表达，结果显示，这两种突变体的乳酸化水平与野生型 ME2 相比显著降低。序列比对分析表明，K352 在不同物种中高度保守。用乳酸钠处理转染了野生型 ME2 或 K352R 突变体的 HEK293T 细胞，发现乳酸钠能显著增强野生型 ME2 的乳酸化水平，而 K352R 突变体的乳酸化水平则无明显变化，这些都证实了 K352 是 ME2 的主要乳酸化位点。
- SIRT3 与 ME2 相互作用并使其去乳酸化：由于 ME2 主要定位于线粒体，研究人员考虑 Sirtuin 家族蛋白可能参与 ME2 乳酸化的调控。泛 Sirtuin 家族蛋白抑制剂烟酰胺（NAM）处理细胞后，ME2 乳酸化水平显著增加，表明 ME2 乳酸化受 Sirtuin 家族成员调节。转染 SIRT1 - 7 表达质粒后发现，只有 SIRT3 能显著降低 ME2 乳酸化水平。内源性 Co - IP 实验进一步证实了 HCT116 细胞中 ME2 和 SIRT3 的直接相互作用，免疫荧光分析显示二者在线粒体中明显共定位。过表达 SIRT3 可显著降低 ME2 乳酸化，而其酶活性失活的突变体（H248Y）则无此作用。并且，SIRT3 介导的去乳酸化作用在野生型 ME2 中存在，而在 K352R 突变体中不存在，敲低 SIRT3 会增加野生型 ME2 的乳酸化水平，但对 K352R 突变体无明显影响，这些都表明 SIRT3 与 ME2 相互作用并催化其在 K352 位点的去乳酸化。
- SIRT3 在 K352 位点的去乳酸化抑制 ME2 活性：乳酸钠处理能以剂量依赖的方式显著增加 ME2 的酶活性。与野生型 ME2 相比，K352R 突变体的酶活性明显降低，而 K352Q 突变体则无显著差异。敲低 SIRT3 可增强野生型 ME2 的酶活性，但对 K352R 突变体无影响；过表达 SIRT3 则降低 ME2 活性，而 SIRT3 H248Y 突变体无此作用。并且，SIRT3 不改变 K352R 突变体的活性，进一步证实了 K352 在通过去乳酸化调节 ME2 活性中的关键作用。
- ME2 K352 乳酸化调节线粒体呼吸和氧化还原稳态：在 HCT116 细胞中敲低内源性 ME2，然后用 shRNA 抗性的 Flag 标记的野生型 ME2 或 ME2 K352R 进行重组。结果显示，表达 K352R 突变体的细胞中活性氧（ROS）水平显著升高，NADP+/NADPH 比值增加，表明氧化还原平衡被破坏。由于 K352R 突变体催化活性降低，重组细胞中苹果酸水平升高，丙酮酸水平相应降低。此外，与野生型 ME2 相比，表达 K352R 突变体的细胞乳酸水平增加，耗氧率（OCR）和 ATP 生成显著降低，这些都突出了 ME2 K352 乳酸化在维持线粒体呼吸和细胞氧化还原稳态中的关键作用。
- ME2 K352 去乳酸化抑制肿瘤生长：体外实验中，表达 K352R 突变体的 HCT116 细胞增殖和集落形成能力明显低于野生型 ME2。体内实验中，异种移植瘤模型显示，与野生型 ME2 相比，表达 ME2 K352R 的肿瘤体积和重量显著降低。Ki - 67 免疫组化染色进一步证实，表达 K352R 突变体的肿瘤细胞增殖活性低于野生型 ME2 组，这些结果强调了 ME2 K352 去乳酸化的抑瘤作用及其在调节肿瘤代谢中的关键功能。
研究结论和讨论部分指出，ME2 是细胞代谢的关键调节因子，在肿瘤发生和免疫调节中都具有重要作用。本研究首次揭示了 ME2 在 K352 位点的乳酸化增强了其酶活性，促进了 NADPH 生成和线粒体呼吸，而 SIRT3 介导的 ME2 K352 去乳酸化则抑制了 ME2 活性，破坏了氧化还原平衡，进而抑制了结直肠癌的生长。此前对乳酸化的研究主要集中在组蛋白乳酸化及其对基因表达的影响，对非组蛋白蛋白尤其是代谢酶的乳酸化研究较少。本研究表明乳酸化也能调节线粒体蛋白 ME2 的功能，为理解乳酸化如何影响细胞代谢和肿瘤进展提供了新视角。此外，SIRT3 作为 ME2 的去乳酸化酶，其作用丰富了对 SIRT3 功能的认识，进一步证实了其在对抗肿瘤代谢重编程中的关键作用。这些发现为肿瘤代谢的调控网络提供了新的见解，也为以 ME2 乳酸化为靶点的癌症治疗提供了潜在的新途径，有望为癌症患者带来新的希望。
