腺嘌呤碱基编辑联合受体靶向纳米颗粒：治疗囊性纤维化 G542X 突变的新希望

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Adenine base editing of CFTR using receptor targeted nanoparticles restores function to G542X cystic fibrosis airway epithelial cells

囊性纤维化（CF）的 G542X 突变导致 CF 跨膜电导调节蛋白（CFTR）功能缺失，现有 CF 调节剂疗法无法治疗该突变。研究人员用受体靶向纳米颗粒（RTN）递送腺嘌呤碱基编辑器（ABE8e Cas9）及相关质粒，对 CF 气道上皮细胞进行编辑。结果表明，编辑可恢复 CFTR 功能，为该突变治疗提供了可行方案。

　　囊性纤维化（Cystic Fibrosis，CF）是一种常染色体隐性遗传的严重疾病，由 CF 跨膜电导调节蛋白（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator，CFTR）基因突变引起。CFTR 基因编码的蛋白是一种阴离子通道，突变会破坏其正常功能，导致上皮组织如肺部出现表面水化缺失、黏液潴留、感染和炎症等问题。目前，CF 调节剂疗法虽对部分患者有效，但对于约 10% 因基因变异导致 CFTR 蛋白无法产生的患者却无能为力。其中，G542X 突变是导致 CF 的常见变异之一，它会使 mRNA 产生提前终止密码子，引发无义介导的 mRNA 降解（nonsense-mediated decay，NMD），进而导致 CFTR 蛋白缺失。因此，寻找针对这类患者的有效治疗方法迫在眉睫。

在此背景下，来自伦敦大学圣乔治学院、伦敦大学学院大奥蒙德街儿童健康研究所、堪萨斯大学医学中心等机构的研究人员开展了一项重要研究。他们利用受体靶向纳米颗粒（Receptor Targeted Nanoparticles，RTN）递送腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor，ABE8e Cas9）和引导 RNA（single guide RNA，sgRNA）/ 增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）质粒，对携带纯合 CFTR G542X 突变的人 CF 鼻上皮细胞进行编辑，试图将终止密码子转换为 G542R，使突变细胞对现有的 CF 调节剂疗法敏感。该研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》杂志上。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养技术，包括培养人 BMI1 转导的非 CF（NHNE）和 hTERT Bmi - 1 转导的 G542X CF 鼻上皮细胞（CFNE G542X）。其次是基因编辑技术，利用 RTN 将 ABE8e Cas9 和相关质粒转染到细胞中。此外，还运用了流式细胞术（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS）筛选 EGFP 表达细胞，以及多种检测技术，如下一代测序（Next-generation sequencing，NGS）分析编辑效率、实时定量聚合酶链反应（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）检测 mRNA 丰度、蛋白质免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达等。

研究结果如下：

• RTN 递送的 ABE 精确编辑 G542X：RTN 携带的 ABE 质粒转染 CFNE G542X 细胞后，未分选细胞中有 17% 的等位基因被编辑为 G542R，分选后的细胞中这一比例达 52%，且相邻腺嘌呤未被编辑，脱靶编辑极少。
• RTN 递送的 ABE 对 IL - 6 和 IL - 8 分泌影响小：转染 RTN 或含 ABE 的 RTN 仅引起 IL - 6 小幅度升高，显著低于 IL - 1β 刺激的反应，对 IL - 8 分泌无影响。
• RTN 递送的 ABE 恢复 CFTR mRNA 和蛋白丰度：编辑后的细胞在气液界面（Air - Liquid - Interface，ALI）培养时，17% 编辑的细胞中 CFTR mRNA 丰度有所增加，52% 编辑的细胞中其 mRNA 丰度恢复到非 CF 细胞水平。同时，编辑后的细胞中 CFTR 蛋白表达增加，成熟的 CFTR 蛋白带 C 丰度上升，经 ETI（elexacaftor - tezacaftor - ivacaftor）处理后进一步增加。
• RTN 递送的 ABE 恢复 CFTR 介导的阴离子转运、气道表面液体（Airway Surface Liquid，ASL）高度和 pH：17% 编辑的细胞经 ETI 处理后，阴离子转运显著增加；52% 编辑的细胞在无 ETI 处理时，阴离子转运就增加到非 CF 细胞的 41%，经 ETI 处理后与非 CF 细胞无差异。此外，编辑后的细胞 ASL 高度和 pH 在 VIP 刺激下也恢复正常。
• RTN 递送的 ABE 恢复细胞迁移和伤口修复的方向性：CFNE G542X 细胞的伤口修复速度和方向性存在缺陷，编辑和 ETI 处理后得到改善。
• RTN 递送的 ABE 编辑的细胞在 ALI 培养时呈现正常细胞类型和结构：编辑后的细胞在 ALI 培养时，分化为纤毛细胞、分泌细胞，且紧密连接蛋白 ZO - 1 的表达与非 CF 细胞相似。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功利用 RTN 递送 ABE 对 CFTR G542X 突变进行编辑，获得了较高编辑效率且脱靶效应低。编辑后的细胞功能得到恢复，对 ETI 治疗有良好反应，部分恢复了非变异 CFTR 的功能，推动了气道关键生理过程的正向改变。这为 CF 患者中 G542X 突变的治疗提供了一种可行的概念验证，为未来进一步优化体内递送方式、提高编辑效率奠定了基础，有望为 CF 的治疗带来新的突破，具有重要的临床意义和应用前景。