Micro-proteomics 揭示 Sertoli 细胞唯支持细胞综合征关键机制：SPARC/FGF2/CDH1 通路的调控作用

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Micro-proteomics reveals distinct protein profiles and SPARC/FGF2/CDH1 regulation of human Sertoli cells between Sertoli cell-only syndrome and normal men

为解决传统蛋白质组学难以对比 Sertoli 细胞唯支持细胞综合征（SCOS）与正常男性支持细胞（Sertoli cells）蛋白质表达差异的问题，研究人员开展 SCOS 患者与梗阻性无精子症（OA）患者 Sertoli 细胞的微蛋白质组学研究，发现 SPARC/FGF2/CDH1 通路异常，这为 SCOS 诊疗提供新方向。这项研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》杂志上

　　

研究背景

在男性生殖健康领域，Sertoli 细胞唯支持细胞综合征（Sertoli cell-only syndrome，SCOS）是一种极为棘手的病症，它属于严重的非梗阻性无精子症（non-obstructive azoospermia，NOA）。患者的睾丸生精小管内仅有支持细胞（Sertoli cells），却没有任何雄性生殖细胞，这直接导致了精子无法产生，男性生育的希望就此破灭。目前，对于完全型 SCOS 患者，医学上还没有有效的干预手段能够恢复其生精功能，他们几乎不可能实现自然生育。

为了攻克这一难题，深入了解 SCOS 的发病机制迫在眉睫。此前，虽然有研究发现 SCOS 可能与多种蛋白质的改变有关，比如胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）及其受体的突变会影响精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）的自我更新和分化，进而引发 SCOS；细胞外基质蛋白和细胞黏附分子的异常会破坏 Sertoli 细胞与雄性生殖细胞之间的相互作用，导致生殖细胞逐渐减少并最终引发 SCOS 。但是，由于获取足够的人类睾丸组织困难重重，且人类细胞的可获取性有限，传统的蛋白质组学方法在研究 SCOS 患者与正常男性 Sertoli 细胞的蛋白质表达差异时显得力不从心。它需要数百万个细胞才能进行分析，这对于从个体 SCOS 患者中获取蛋白质信息来说，几乎是不可能完成的任务。

正是在这样的背景下，来自湖南师范大学医学院等机构的研究人员决定另辟蹊径，开展了一项具有创新性的研究。他们希望通过新的技术手段，揭示 SCOS 发病的潜在分子机制，为改善 SCOS 的诊断和治疗策略提供有力的理论支持。这项研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》杂志上，引起了广泛关注。

研究方法

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：

1. 细胞分离技术：从 2023 年 3 月至 2024 年 5 月，研究人员收集了上海总医院 SCOS 和 OA 患者的睾丸组织。通过两步酶消化法，先使用含特定成分的消化液处理组织，再进行差速贴壁培养 3 小时，成功分离出高纯度的人类 Sertoli 细胞。

2. 微蛋白质组学技术：对分离得到的 100 个人类 Sertoli 细胞进行微蛋白质组学分析。该技术仅需少量细胞就能实现深度的蛋白质组覆盖。通过一系列复杂的操作，包括蛋白质提取、酶解、脱盐、肽段浓度鉴定等，研究人员得以大规模地鉴定蛋白质，并对比 SCOS 患者与 OA 患者 Sertoli 细胞的蛋白质表达差异。

3. 基因调控与检测技术：运用 siRNAs 转染技术沉默 SPARC 基因，以及转染 FGF2 过表达质粒来调控基因表达。通过实时定量 PCR（qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blots）、免疫细胞化学（immunocytochemistry）、免疫组织化学（immunohistochemistry）等多种检测技术，从基因和蛋白质水平分析相关分子的表达变化，以及对 Sertoli 细胞功能的影响。

4. 细胞功能检测技术：利用流式细胞术（flow cytometry）检测细胞凋亡情况；通过细胞计数试剂盒 - 8（cell counting kit-8，CCK8）检测细胞增殖能力；进行细胞黏附实验评估细胞黏附功能；借助透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察细胞超微结构；使用荧光探针 JC-1 检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP） ，全面了解 Sertoli 细胞的功能状态。

研究结果

1. Sertoli 细胞的分离与鉴定：研究人员从 SCOS 患者和 OA 患者的睾丸组织中成功分离出 Sertoli 细胞。通过 H&E 染色发现，OA 患者生精小管内有正常的雄性生殖细胞和 Sertoli 细胞，而 SCOS 患者生精小管内只有 Sertoli 细胞。免疫细胞化学和流式细胞术检测结果表明，分离得到的细胞为 Sertoli 细胞，其纯度高达 98%，这为后续研究奠定了坚实基础。

2. 微蛋白质组学揭示蛋白质表达差异：微蛋白质组学分析显示，SCOS 患者 Sertoli 细胞与 OA 患者相比，有 1520 种蛋白质上调，158 种蛋白质下调。基因本体（Gene Ontology，GO）分析表明，上调的蛋白质主要与 mRNA 剪接、翻译和细胞内蛋白质运输相关；下调的蛋白质则主要集中在细胞黏附、蛋白水解、血管生成、血液凝固和细胞 - 基质黏附等通路。蛋白质 - 蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析进一步揭示了这些差异表达蛋白质在相关通路中的关键作用。

3. SPARC 对 Sertoli 细胞功能的影响：研究发现，SCOS 患者 Sertoli 细胞中 SPARC 的 mRNA 和蛋白质表达均下调。沉默 SPARC 后，Sertoli 细胞的凋亡显著增加，细胞黏附功能下降，相关黏附蛋白表达减少，且 FGF2 表达上调。这表明 SPARC 的下调可能通过影响 FGF2 的表达，破坏 Sertoli 细胞的正常功能，进而参与 SCOS 的发病过程。

4. FGF2 对 Sertoli 细胞功能的影响：SCOS 患者 Sertoli 细胞中 FGF2 表达上调。敲低 FGF2 后，细胞黏附相关蛋白的表达增加；过表达 FGF2 则导致细胞黏附相关蛋白表达减少，细胞黏附能力下降。这说明高表达的 FGF2 会降低 Sertoli 细胞的黏附功能，与 SCOS 的发生密切相关。

5. Sertoli 细胞凋亡情况：与 OA 患者相比，SCOS 患者 Sertoli 细胞的凋亡明显增加。通过多种实验方法检测发现，SCOS 患者 Sertoli 细胞的线粒体凋亡通路被激活，凋亡相关基因和蛋白表达上调。这表明细胞凋亡的异常增加可能是导致 SCOS 患者生精功能障碍的重要原因之一。

研究结论与讨论

综合上述研究结果，研究人员发现 SCOS 患者 Sertoli 细胞中 SPARC/FGF2/CDH1 通路存在异常，这导致了 Sertoli 细胞黏附功能下降，血睾屏障（blood-testis barrier，BTB）功能受损，最终引发 SCOS。

这项研究具有重要意义。一方面，它为 SCOS 的发病机制提供了新的见解，让人们对 SCOS 的认识更加深入。另一方面，研究结果表明 SPARC 有可能成为 SCOS 诊断和治疗的潜在生物标志物和靶点，为开发精准治疗 SCOS 和男性不育的策略提供了理论依据。不过，目前对于 SPARC 调节 FGF2 表达的具体机制还不清楚，仍需要进一步研究。未来，研究人员可以利用动物基因敲除模型，深入探究 SPARC 功能缺失与 SCOS 之间的关系，为攻克 SCOS 这一难题提供更多的科学依据，也为男性生殖健康领域的研究开辟新的方向。