降低适用于冷冻保存的 Jurkat 细胞制剂中二甲亚砜（Me2SO）含量的研究：开拓细胞冻存新方向

为解决细胞治疗产品冷冻保存中二甲亚砜（Me2SO）的危害及储存难题，研究人员以 Jurkat 细胞为模型，采用实验设计（DoE）方法筛选冷冻保存配方。结果发现多种有潜力的辅料组合，且 - 80℃储存可行，为优化细胞冻存提供了新方向。

　　细胞治疗产品（Cell-based medicinal products，CBMPs）和基因治疗产品在生物制药领域蓬勃发展，为癌症、遗传疾病等重症患者带来了新希望。然而，CBMPs 的储存问题却成了制约其发展的 “拦路虎”。目前，常用的冷冻保存方法是在配方中添加高达 10% 的二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，Me₂SO），并在低于 - 145℃的环境下储存。Me₂SO 虽能在冷冻过程中有效保护细胞，但在常温下却会对细胞造成损伤，还可能给患者带来胃肠道、心血管和神经系统等方面的副作用。此外，储存过程中需要耗费大量能源的液氮或超低温冰箱，这不仅成本高昂，还增加了供应链的复杂性。为了攻克这些难题，来自国外的研究人员开展了一项针对 Jurkat 细胞（一种永生 T 细胞系，常作为 CAR-T 细胞模型）冷冻保存配方的研究。该研究成果发表在《Cryobiology》杂志上。

研究人员运用了实验设计（Design of experiment，DoE）和单因素优化（One-factor-at-a-time，OFAT）两种关键技术方法。在 DoE 方法中，研究人员选取了 Me₂SO、海藻糖（trehalose）、山梨醇（sorbitol）、脯氨酸（proline）、依克多因（ectoine）、泊洛沙姆 188（poloxamer 188，P188）和聚乙烯吡咯烷酮 40（poly vinyl pyrrolidone 40，PVP）这 7 种不同的辅料，根据文献值和配方的渗透压确定其浓度范围，设计出 17 种不同配方。通过测量冻存后细胞活力（基于 CalceinAM 检测）和玻璃化转变温度（T_g’）这两个响应因素，构建 DoE 模型预测最佳配方。OFAT 方法则是从 DoE 研究中挑选有潜力的辅料，每次只改变一种辅料进行优化。

一、细胞培养
研究选用 Jurkat 细胞，从 CLS GmbH 购买，使用添加 10% 胎牛血清（Fetal calf serum，FCS）的罗斯威尔帕克纪念研究所 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640，RPMI 1640）培养基进行培养，将细胞密度维持在 0.5×10⁶ - 3×10⁶ cells/ml。
二、配方预筛选（基于 DoE）
采用初始部分因子实验设计，分辨率为 IV，7 种辅料各设两个浓度，得到 17 种配方。研究发现冻存后细胞活力与 Me₂SO 的存在有明显相关性，Me₂SO 浓度越高，细胞活力越高。
三、稳定性研究
对有潜力的候选配方进行为期三个月、不同储存温度（-145℃、-80℃、-40℃）的稳定性研究，并以 Cryostor CS10（含 10% Me₂SO）、CryoSOfree（无 Me₂SO 的冷冻保存培养基）和 10% Me₂SO 的 RPMI 1640 作为对照。结果显示，大多数配方在 - 145℃和 - 80℃储存时细胞活力相似，-40℃储存的样本则无法存活。总体上，对照配方的细胞活力略高于测试配方。
四、细胞再培养及活力评估
将 - 80℃储存的细胞样本在细胞培养中重新培养 24 小时后评估活力，发现 24 小时后的细胞活力比解冻后直接分析的细胞活力低得多，这表明冻融损伤在解冻后仍会持续发展。

研究结论表明，研究人员成功筛选出了多种有潜力的辅料及组合，如海藻糖和 PVP，可用于降低 Me₂SO 浓度或无 Me₂SO 的 Jurkat 细胞冷冻保存。此外，开发的配方在 - 80℃储存是可行的。该研究意义重大，为优化细胞冷冻保存配方提供了新的方向，有助于减少 Me₂SO 带来的潜在风险和副作用，降低储存成本，简化供应链，推动细胞治疗产品的发展，让更多患者受益于先进的细胞治疗技术。