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本文聚焦拟南芥减数分裂，发现组蛋白变体 H2A.W 可限制异染色质区域的交换（crossover）。通过基因沉默（meiMIGS）及突变体研究，证实其作用机制与异染色质压实、H3K9me2 水平相关。该研究为解锁异染色质交换提供新思路。
研究背景
在减数分裂过程中，同源染色体通过交换（crossover）事件相互交换遗传物质，这一过程对产生遗传多样性至关重要。减数分裂重组起始于 SPO11 及其相关蛋白形成的 DNA 双链断裂（DSBs）。在植物中，减数分裂 DSBs 的数量远超过最终形成的 crossover 数量，大部分 DSBs 通过姐妹染色单体修复或处理为非交换。crossover 主要通过 I 类和 II 类两种途径形成，其中 I 类途径在拟南芥中负责约 85% - 90% 的 crossover，由 E3 连接酶 HEI10 介导，具有干扰现象；II 类途径通过核酸内切酶 MUS81 介导剩余少数 crossovers，且受多种抗交换因子限制。
在拟南芥中，减数分裂 DSBs 和 crossovers 与染色质可及性和基因密度相关，在富含转座子的着丝粒周围异染色质区域受到强烈抑制。着丝粒周围异染色质的特征包括 DNA 甲基化、组蛋白 H3 赖氨酸 9 二甲基化（H3K9me2）、组蛋白 H3 赖氨酸 27 一甲基化（H3K27me1）、连接组蛋白 H1 的一定程度富集以及组蛋白 H2A 变体 H2A.W 的特异性结合。此前研究发现，失活催化 H3K9me2 的组蛋白甲基转移酶 SU (VAR) 3 - 9 HOMOLOG 4（SUVH4）、SUVH5 和 SUVH6，或 DNA 甲基转移酶 CHROMOMETHYLASE 3（CMT3）会增加着丝粒周围 crossovers；而维持异染色质 CG DNA 甲基化的 DNA METHYLTRANSFERASE 1（MET1）或参与 CG 和非 CG 甲基化的 DECREASE IN DNA METHYLATION 1（DDM1）突变，则与着丝粒周围 crossovers 减少和染色体臂上 crossovers 增加有关，表明异染色质组织因子与 crossover 形成之间存在复杂关系。拟南芥有三个基因 H2A.W.6、H2A.W.7 和 H2A.W.12 编码 H2A.W 异构体，其在异染色质压实中起作用，但 H2A.W 是否限制着丝粒周围 crossovers 尚不清楚。
研究方法
- 基因沉默技术（meiMIGS）：利用减数分裂特异性基因 DISRUPTION OF MEIOTIC CONTROL 1（DMC1）的启动子，对微 RNA 诱导的基因沉默（MIGS）方法进行改进，构建 meiMIGS 载体。在载体中插入 microRNA173（miR173）靶序列（miR173 - ts），使其在减数分裂期间表达并被切割，产生 22 - 核苷酸的反式作用短干扰 RNA（siRNAs），从而沉默相应的内源性靶转录本。将 meiMIGS 转基因植物构建在拟南芥荧光标记系（FTLs）中，通过分析荧光种子或花粉来测量 crossover 频率。
- 基因编辑技术（CRISPR/Cas9）：使用 CRISPR/Cas9 介导的诱变技术，在拟南芥 Col - 0 和 Ler 背景下生成新的 h2a.w 缺失等位基因。设计一对单向导 RNA（sgRNA）诱导每个 H2A.W 基因的功能缺失突变，通过 PCR 扩增、凝胶电泳分析和 Sanger 测序检测突变情况。
- 基因分型测序（GBS）：对 Col - 0 和 Ler 杂交后代的 F2个体进行 GBS，以生成高分辨率的基因组交换图谱，确定 crossover 的位置和频率。
- 微球菌核酸酶测序（MNase - seq）：对含有减数分裂细胞的花芽（< ~ 2mm 或～0.3 - 0.5mm）和 10 日龄幼苗进行 MNase - seq，测量 h2a.w 突变体和野生型（WT）拟南芥全基因组染色质可及性。
- 免疫染色和免疫印迹分析：对雄性减数分裂细胞进行 H3K9me2 和减数分裂染色体轴成分 ASY1 的免疫染色，通过免疫印迹分析检测 H3K9me2 水平，研究 h2a.w 突变体、meiMIGS - H2A.W.6/7/12、meiMIGS - SUVH4/5/6 等品系在减数分裂期间 H3K9me2 水平的变化。
研究结果
- 减数分裂中三个 H2A.W 基因沉默增加异染色质交换：通过 meiMIGS 技术分别沉默 SUVH4/5/6、CMT3/2 和 H2A.W.6/7/12 基因，结果显示，与野生型相比，这些转基因植物在 CTL3.9 和 CEN3 区域的 crossover 频率均显著增加。RT - qPCR 分析证实 meiMIGS 转基因有效沉默了内源性靶基因，表明 H2A.W.6、H2A.W.7 和 H2A.W.12 在限制异染色质区域 crossovers 中起重要作用。
- meiMIGS - H2A.W.6/7/12 后代的全基因组交换图谱：对 meiMIGS - H2A.W.6/7/12（mmH2A.W）和 meiMIGS - SUVH4/5/6（mmSUVH）转基因植物与 Ler 杂交后代进行 GBS 分析。结果表明，mmH2A.W 和 mmSUVH 的 Col - 0 × Ler F1杂种后代在 CTL3.9 区间的 crossover 频率显著增加，且全基因组分析显示，这些转基因植物在着丝粒周围区域的 crossovers 数量增加，而染色体臂上的 crossovers 数量减少，表明 meiotic knockdown of H2A.W.6/7/12 或 SUVH4/5/6 重塑了染色体上的交换景观。
- H2A.W.6 和 H2A.W.7 是抑制异染色质交换所必需的：将 CTL3.9 报告基因与 h2a.w - 2 三缺失突变体杂交，测量不同 h2a.w 突变背景下 CTL3.9 区间的 crossover 频率。结果显示，h2a.w.6、h2a.w.7、h2a.w.6,7、h2a.w.6,12、h2a.w.7,12 和 h2a.w.6,7,12 突变体的 crossover 频率增加，而 h2a.w.12 突变体无显著变化。RNA - 测序数据显示 H2A.W.6 和 H2A.W.7 的表达量高于 H2A.W.12，表明 H2A.W.6 和 H2A.W.7 在抑制异染色质 crossovers 中起主要作用，且功能冗余。
- h2a.w 突变体中异染色质交换增加：利用 GBS - 基于的交换图谱分析 h2a.w 突变体中单个和复合突变对异染色质 crossovers 的影响。结果显示，h2a.w.6、h2a.w.7、h2a.w.6,7 和 h2a.w.6,7,12 突变体中，染色体臂相关的常染色质 crossovers 减少，而着丝粒周围相关的异染色质 crossovers 增加。对 crossover 干扰的分析表明，h2a.w 突变体中 crossover 干扰仍然存在，且由于异染色质 crossovers 增加，导致染色体臂上的 crossovers 减少。
- h2a.w 突变体中基因和短转座元件附近的异染色质交换增加：利用高分辨率 GBS 数据，研究 mmH2A.W 品系和 h2a.w 突变体中额外的着丝粒周围 crossovers 是否发生在基因或转座元件（TEs）附近。结果发现，与野生型相比，这些品系和突变体在基因上下游和基因体内的着丝粒周围 crossovers 数量增加，且在短于 1kb 的 TEs 上下游的异染色质 crossovers 也增加，其中短 Helitrons 与 crossovers 的关联更频繁，而 Gypsy RNA TEs 的关联较低。
- h2a.w 突变体中异染色质可及性增加：MNase - seq 分析显示，h2a.w.6、h2a.w.7、h2a.w.6,7 和 h2a.w.6,7,12 突变体在着丝粒周围区域的核小体密度降低，染色质可及性增加。对 H2A.W.6 和 H2A.W.7 特异性 ChIP - seq 峰的分析表明，这两种蛋白在异染色质压实中起重要且部分冗余的作用。此外，mmH2A.W 品系和 h2a.w 突变体中增加的异染色质 crossovers 在 H2A.W.6/7 ChIP - seq 峰上下游富集，且异染色质 crossovers 与着丝粒周围区域的可及染色质紧密相关。
- mmH2A.W 品系和 h2a.w 突变体减数分裂异染色质中 H3K9me2 水平降低：免疫染色和免疫印迹分析显示，h2a.w.6、h2a.w.7、h2a.w.6,7、h2a.w.6,7,12 突变体和 mmH2A.W 品系在减数分裂前期 I 的 H3K9me2 水平降低，表明 H2A.W 驱动的异染色质压实对于维持减数分裂前期 I 的 H3K9me2 水平至关重要。
研究结论
本研究表明，减数分裂特异性敲低或敲除编码 H2A.W 变体的基因可增加拟南芥着丝粒周围异染色质的 crossovers 数量。H2A.W.6 和 H2A.W.7 在抑制异染色质 crossovers 中起主要作用，其机制可能与异染色质压实和 H3K9me2 水平降低有关。这一发现为通过调控 H2A.W 解锁异染色质 crossovers 提供了新的见解，同时也为在作物物种中进行重组或定位有利数量性状位点提供了潜在策略。未来研究可进一步探索其他异染色质组织因子与 H2A.W 和 H3K9me2 / 非 CG 甲基化的组合，以及 I 类和 II 类途径中的促交换和抗交换因子基因，以最大化异染色质 crossovers 并打破连锁累赘。
