PA (S184N) 与 PB2 (E627K) 突变协同增强 H3N2 犬流感病毒致病性，为公共卫生防控敲响警钟

本文聚焦犬流感病毒（CIV），研究发现 PA (S184N) 和 PB2 (E627K) 突变协同增强 H3N2 CIV 对小鼠和犬的致病性。通过构建致死模型、分析突变影响及机制，揭示病毒逃避宿主免疫并引发炎症反应，为 CIV 防控提供关键依据。

　　

研究背景

21 世纪以来，人畜共患病毒频繁跨越物种屏障，如 H1N1 流感病毒（IAV）、H5N1 和 H7N9 禽流感病毒（AIV）等，给全球公共卫生带来巨大挑战，迫切需要研究其跨物种传播机制和流行病学特征。IAV 宿主范围广泛，基因组易发生遗传突变和重配，可通过直接传播和基因重配两种途径实现宿主转换。犬易感染多种 IAV 亚型，H3N2 CIV 在犬群中广泛传播且对哺乳动物适应性增强，具有潜在的跨物种传播风险，研究其适应哺乳动物的机制至关重要。

建立致死性 H3N2 CIV 小鼠感染模型

为构建致死性小鼠模型，用 GD14-WT 株在 4、5、6 周龄小鼠肺部连续传代，监测体重和存活率 14 天。4 周龄小鼠体重变化小，5 周龄小鼠第 13 代传代时体重明显下降但无死亡，6 周龄小鼠第 18 代传代时体重显著下降，第 5 天全部死亡。通过空斑实验纯化第 18 代病毒，筛选出 GD14-P18C 株（即 GD14-MA），其毒力高于其他株。与 GD14-WT 相比，GD14-MA 感染小鼠的肺病毒滴度更高，引发严重肺炎，病理表现为纤维蛋白渗出和炎症细胞浸润，免疫组化检测到病毒核蛋白广泛存在。基因组测序显示，GD14-MA 相对 GD14-WT 有 8 个氨基酸突变，分布在 5 个病毒片段上。

PA (S184N) 和 PB2 (E627K) 突变在 GD14-MA 小鼠感染中的协同致死效应

以 GD14-WT 为遗传背景构建重组病毒，用单片段和双片段替换的重组病毒感染小鼠。单片段替换组中，GD14-ma (M) 和 GD14-ma (PA) 组小鼠体重下降，其他组无明显变化，且所有单片段替换组均无死亡。双片段替换组中，GD14-ma (PA + PB2) 组小鼠体重迅速下降，第 5 天全部死亡。进一步构建含特定突变的重组病毒，发现 GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组小鼠体重快速下降，第 5 天全部死亡，而单突变病毒株 GD14-ma [PA (S184N)] 组小鼠体重无明显变化且无死亡，证实 PA (S184N) 和 PB2 (E627K) 是 GD14-MA 致死小鼠的关键突变，二者协同发挥致死作用。

分析 H3N2 AIV、CIV、SIV 和 HuIAV 的 PA 和 PB2 基因序列，发现 PA (184S) 在 AIV、CIV 和 SIV 中占主导，PA (184N) 在 HuIAV 中占主导；PB2 (627E) 在 AIV、CIV 和 SIV 中占主导，PB2 (627K) 在 HuIAV 中占主导。系统发育分析表明各病毒亚型的 PA 和 PB2 基因片段进化模式不同。聚合酶活性检测显示，GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 株聚合酶活性显著高于 GD14-WT 株。感染小鼠后，3 天的病毒滴度两组无显著差异，5 天的 GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组病毒滴度显著降低。病理检查发现，GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组引发严重肺炎，但 5 天时病毒核蛋白在感染肺中未广泛检测到。

GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 株对犬致病性增强

用 9 - 12 周龄比格犬评估 GD14-WT、GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 和 GD14-MA 株的致病性。感染后监测体温和临床症状 8 天，采集鼻拭子和血清样本，3 天处死部分犬进行解剖和组织学分析。结果显示，GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 和 GD14-MA 组犬从第 3 天出现明显临床症状，临床评分显著高于 GD14-WT 组；所有感染组 3 - 5 天体温升高；GD14-MA 组鼻拭子病毒滴度在 3、4 天显著高于 GD14-WT 组，GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组与 GD14-WT 组无显著差异；6 天 GD14-MA 组产生血清抗体，9、12、14 天三组血清抗体水平无显著差异；GD14-MA 组在肺、气管和鼻甲的病毒复制滴度显著高于 GD14-WT 组，GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组与 GD14-WT 组无差异；解剖和组织学检查发现，GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 和 GD14-MA 组肺损伤更严重，病毒核蛋白检测结果显示两组病毒在肺中的分布不同。

GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 株逃避宿主抗病毒防御

为探究 GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 和 GD14-WT 株致病性差异，采集感染 3 天的小鼠左肺细胞进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。分析 21,589 个细胞，鉴定出 11 个细胞簇，包括上皮细胞、内皮细胞等非免疫细胞簇和肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞簇。差异表达基因（DEGs）分析发现，两组感染小鼠肺组织与对照组相比转录变化显著，且均上调了抗病毒基因表达。但 GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组在除平滑肌细胞（SMC）外的所有细胞簇中，抗病毒相关基因表达显著低于 GD14-WT 组，表明该毒株逃避宿主抗病毒防御能力增强。

GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 株引发小鼠肺部感染的炎症反应和细胞因子风暴

过度免疫反应可引发细胞因子风暴，导致组织损伤和宿主死亡。分析与 “炎症反应” 相关的 DEGs，发现肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞（MoMac）是炎症介质的主要来源。GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组上调的炎症基因数量多于 GD14-WT 组，且在多种细胞类型中炎症因子的种类和数量增加，尤其是上皮细胞、内皮细胞等。趋化因子 CCL6 在 GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组多种细胞类型中特异性上调，预测其细胞间通讯网络显示存在广泛的配体 - 受体相互作用，可能导致炎症性肺损伤。

宿主细胞感染模式和病毒转录本在小鼠肺组织中的表达

通过单细胞分辨率追踪细胞内分段 mRNA 鉴定 CIV 感染的宿主细胞，将细胞分为高感染（H）、低感染（L）和未检测到（U）三类。GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 组低感染细胞比例略高于 GD14-WT 组，两组高病毒载量细胞比例无差异。GD14-WT 株在上皮细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞中病毒基因表达高，GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 株在上皮细胞和内皮细胞中病毒基因表达高。

研究讨论

本研究成功建立 H3N2 CIV 致死小鼠模型，分离出致死株 GD14-MA，确定 PA (S184N) 和 PB2 (E627K) 是小鼠致死的关键突变，且 GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 株对犬致病性增强。该毒株不通过增加复制滴度增强致病性，而是逃避宿主抗病毒反应并引发强烈炎症反应。PB2 E627K 突变对 IAV 致病性影响多样，PA (S184N) 突变在 HuIAV 中较高的流行率值得进一步研究。scRNA-seq 揭示了小鼠对 CIV 感染的反应机制，GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 株抑制抗病毒反应、上调炎症基因表达，CCL6 可能在炎症反应中起重要作用。本研究通过交替在不同年龄小鼠传代，快速建立致死小鼠模型，为低致病性 IAV 小鼠适应模型构建提供新方法。

材料与方法

1. 病毒和细胞：人胚肾（HEK）293T 细胞和犬肾上皮（MDCK）细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素 - 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，5% CO₂、37°C 培养，H3N2 CIV（GD14-WT）保存在实验室。
2. 建立致死性 H3N2 CIV 小鼠感染模型：用 GD14-WT 株在不同年龄 BALB/c 小鼠肺部连续传代，纯化第 18 代病毒后感染 6 周龄小鼠，监测体重和存活率，采集肺组织进行病毒滴度、组织学和免疫组化检测，实验经伦理委员会批准。
3. 鉴定 GD14-MA 株在小鼠中的关键致死突变：用反向遗传学构建重组病毒，感染小鼠观察体重和存活率，构建含特定突变的重组病毒评估突变作用，采集肺组织进行检测。
4. GD14-WT、GD14-ma [PA (S184N)+PB2 (E627K)] 和 GD14-MA 在犬中的致病性：选择 9 - 12 周龄无 H3N2 CIV 感染的比格犬，分组感染不同毒株，监测临床症状，采集样本，3 天处死部分犬进行解剖和组织学分析。
5. 聚合酶活性检测：将 PA、PB1、PB2、NP 质粒与荧光素酶报告质粒共转染 293T 细胞，用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶产生。
6. 序列比对和系统发育分析：从全球共享所有流感数据倡议（GISAID）下载序列，用 mafft 软件比对，分析突变频率，用 MEGA X 软件构建系统发育树。
7. 单细胞 RNA 测序：采集感染 3 天小鼠左肺细胞，用 BD Rhapsody 系统进行单细胞转录组分析，制备文库后测序。
8. 单细胞 RNA 统计分析：用 fastp 过滤序列，STARsolo 定量基因表达，Seurat 包归一化和缩放数据，进行主成分分析（PCA）和 t - 分布随机邻域嵌入（t - SNE）。
9. 差异基因表达、病毒载量评估和细胞通讯分析：用 FindMarkers 函数分析差异基因表达，根据 CIV 基因表达分类感染细胞，用 CellChat 分析细胞通讯。
10. 统计分析：用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计，结果以均值 ± 标准差（SD）表示，用 Student’s t 检验比较组间差异，用 Kaplan - Meier 法分析动物生存数据。

本研究得到广州市科技局和广东省自然科学基金支持，为 H3N2 CIV 的防控和研究提供了重要依据，有助于深入理解病毒跨物种传播和致病机制，为公共卫生防控策略的制定提供参考 。