基于曲率感应肽nFAAV5-NBD的细菌胞外膜囊泡生成相关基因快速筛选与鉴定

本研究创新性开发基于曲率感应肽nFAAV5-NBD的原位检测技术，实现对革兰阴性菌Shewanella vesiculosa HM13胞外膜囊泡（EMVs）的高通量筛选。通过转座子突变文库筛选，鉴定出16个促EMV生成基因和6个抑制基因，揭示蛋白质量控制、谷氨酸代谢和信号转导系统对EMV生物合成的调控机制，为解析细菌膜囊泡形成机制及生物技术应用提供新策略。

　　

基于曲率感应肽的细菌胞外膜囊泡生成机制研究

ABSTRACT
细菌分泌的胞外膜囊泡（EMVs）作为纳米级脂质颗粒，在生理功能和生物技术应用中具有重要意义。然而，其生物发生的分子机制尚未完全阐明。本研究利用N端取代的硝基苯并恶二唑（NBD）标记曲率感应肽nFAAV5-NBD，开发了一种无需分离EMV与细胞的原位检测技术。

INTRODUCTION
EMVs普遍存在于三域生物中，携带蛋白质、核酸等生物分子，参与基因水平转移和细胞间通讯。革兰阴性菌通过外膜出芽或细胞裂解释放EMVs，但其形态发生受膜稳定性、局部曲率和膜应激等多因素调控。Shewanella vesiculosa HM13以其高产且粒径均一的EMVs成为理想模型，其EMVs主要携带49 kDa的P49蛋白。

RESULTS
Evaluation of EMV-selective binding of nFAAV5-NBD
nFAAV5-NBD能特异性识别EMVs的高曲率区域，在培养液中显示出与EMV浓度正相关的荧光信号，而细胞悬液等无EMV组分无此响应。

In situ rapid evaluation of EMV productivities
通过静态-振荡两阶段培养筛选10,100个转座子突变体，获得18个高分泌株（EMV产量>1.6倍）和8个低分泌株（产量<0.8倍）。典型突变体4-G2产量达野生型的9倍，而96-G11仅31%。

Characterization of selected mutants
纳米颗粒追踪分析（NTA）证实筛选结果可靠性，部分突变体如Δhm2192产生75-125 nm的大尺寸EMVs，显示粒径调控功能。

Genetic analysis
转座子插入位点分析发现：

• 高分泌表型相关基因包括假性二肽羧肽酶（HM4090）、谷氨酸合成酶β亚基（HM3484）、LapG蛋白酶（HM1880）等
• 低分泌表型涉及磷酸烯醇丙酮酸合酶（HM2766）、NAD特异性谷氨酸脱氢酶（HM2704）等

Functional validation
靶向基因敲除证实：

• Δhm1880（LapG蛋白酶）EMV产量增加4.9倍
• Δhm2766（磷酸烯醇丙酮酸合酶）产量降低62%
  互补实验使表型恢复至野生型水平。

DISCUSSION
研究揭示三大调控机制：

1. 蛋白质量控制：HM4090（Dcp）和HM1880（LapG）缺陷导致错误折叠蛋白积累，引发膜应激反应
2. 信号转导：HM3986（PAS-BaeS双组分系统）通过感知氧化还原状态调控EMV分泌
3. 谷氨酸代谢：HM3484和HM2704通过影响谷胱甘肽合成和肽聚糖代谢调节膜稳定性

MATERIALS AND METHODS
采用pMiniHimar RB1转座子系统构建突变库，通过单引物PCR和反向PCR鉴定插入位点。EMV定量使用NanoSight NS300，蛋白分析采用SDS-PAGE与Western blot。

CONCLUSIONS
该研究建立的曲率感应肽筛选技术为EMV研究提供新工具，鉴定的调控基因不仅阐明EMV生物发生机制，更为改造细菌生产功能性纳米载体奠定基础。特别是Δhm4090、Δhm3484等高产菌株，在异源蛋白递送应用中展现出重要价值。