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本文从食塑黄粉虫肠道酵母中发现两种新型角质酶 SiCut1 和 SiCut2。它们能高效降解多种聚酯塑料，研究通过多种实验揭示其特性与作用机制，为塑料废物的酶促降解和循环利用提供新方向，极具科研与应用价值。
引言
塑料垃圾的大量堆积对生态系统和人类健康构成严重威胁。当前塑料垃圾处理方法，如填埋和焚烧，存在长期可持续性问题及二次污染；机械回收产品价值低，化学回收面临反应条件苛刻和能耗高的挑战。酶促回收因能在温和条件下将塑料解聚为小分子单体，且解聚产物可再利用，成为备受关注的方法。
在众多用于塑料降解的酶中，聚酯降解酶尤其是角质酶最为有效。角质酶属于 α/β - 水解酶超家族，与真正的脂肪酶不同，它没有覆盖活性位点的疏水盖子，能容纳高分子量底物，如植物角质的天然聚酯和合成聚酯。根据系统发育分析，已证实具有降解合成聚酯能力的角质酶可分为丝状真菌来源、酵母来源和细菌来源三类。目前已知的产角质酶微生物多从开放环境中分离，从动物肠道系统等封闭或半封闭生物环境中发现产角质酶微生物和聚酯降解角质酶具有重要研究意义。
此前研究发现黄粉虫（Tenebrio molitor幼虫）可摄取并降解聚苯乙烯等多种聚酯塑料，其肠道微生物群在这一过程中发挥重要作用，已从肠道中分离出一些塑料降解细菌和相关聚酯降解酶，但肠道真菌在塑料降解中的作用尚待探索。本研究旨在探究食塑黄粉虫肠道微生物群中是否存在能分解商业聚酯塑料废物的特定真菌或酶。
结果
- 从食塑黄粉虫肠道分离出聚酯降解酵母：研究人员从食塑黄粉虫肠道分离出 5 种不同酵母，通过观察在含聚己内酯（PCL）乳液的固体检测板上形成透明圈的能力，筛选出具有聚酯降解能力的酵母菌株 BIT - D3。当以柠檬酸盐、丙酮酸盐或琥珀酸盐为额外碳源时，BIT - D3 能形成透明圈，而以葡萄糖或乳糖为额外碳源或无额外碳源时则不能。进一步研究发现，BIT - D3 的无细胞上清液可显著降解 PCL 乳液，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析证实了聚酯的降解。该菌株在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂上形成的菌落呈圆形、光滑、凸起，橙红色，直径 1.0 - 1.5mm，细胞为短杆状，无菌丝或假菌丝。经鉴定，BIT - D3 属于Sakaguchia属，命名为Sakaguchia sp. BIT - D3。
- 鉴定两种潜在的聚酯解聚酶 ——SiCut1 和 SiCut2：由于聚酯塑料分子量大，微生物降解需分泌胞外酶。研究人员通过基因组和转录组分析，预测 BIT - D3 分泌的蛋白质，筛选出 84 种经典分泌蛋白和 5429 种非经典分泌蛋白，共注释出 5513 种分泌蛋白。转录组分析发现，在以 PCL 乳液为底物、柠檬酸盐为额外碳源的培养条件下，有 908 种分泌蛋白显著上调。其中，两种分泌蛋白（A02567，A02569）与潜在角质酶V565_000460氨基酸序列同一性较高，被注释为 “角质酶样酶”，分别命名为 SiCut1（GenBank：PQ164790）和 SiCut2（GenBank：PQ164791）。SiCut1 和 SiCut2 与先前报道的角质酶氨基酸序列同一性较低，且具有独特的 GYSKG 基序，在系统发育树中形成单独分支，可能代表新型酵母来源角质酶。
- SiCut1 和 SiCut2 的表达和生化特性：将 SiCut1 和 SiCut2 在P. pastoris GS115 中过表达，SDS - PAGE 分析显示在细胞培养上清液中获得了高纯度的目标蛋白。在 7 天的培养过程中，SiCut1 和 SiCut2 的蛋白浓度逐渐增加，分别达到 160 ± 2μg/mL 和 108 ± 7μg/mL，酶活性也逐渐上升，分别达到 0.41 ± 0.03U/mL 和 0.37 ± 0.02U/mL。SiCut1 和 SiCut2 的最适 pH 分别为 7.0 和 8.0，在 pH 7.0 时稳定性最高。最适温度分别为 35°C 和 45°C，SiCut1 在低于 30°C 时热稳定性较好，SiCut2 在高于 30°C 时热稳定性更优。
- SiCut1 和 SiCut2 对p - 硝基苯酚酯、甘油三酯和角质的水解活性：以一系列不同酰基链长度的p - 硝基苯酚酯和甘油三酯为底物，检测 SiCut1 和 SiCut2 的脂解和酯解活性。结果表明，SiCut1 对pNP - 己酸酯（C6）活性最高，SiCut2 对pNP - 辛酸酯（C8）活性最高，且二者对短链甘油三酯底物的活性高于长链底物。此外，通过气相色谱 - 质谱（GC - MS）分析发现，SiCut1 和 SiCut2 能降解苹果角质，产生 16 - 羟基十六烷酸，证实它们属于角质酶家族。
- SiCut1 和 SiCut2 对各种聚酯塑料的水解活性：以 PCL 膜、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）膜、聚酯 - 聚氨酯（PUR）泡沫等多种聚酯塑料为底物，检测 SiCut1 和 SiCut2 的降解能力。结果显示，SiCut1 能使 PCL 膜几乎完全消失，PBS 膜和聚酯 - PUR 泡沫显著碎片化；SiCut2 能使 PCL 膜和聚酯 - PUR 泡沫显著收缩。通过高效液相色谱 - 质谱（HPLC - MS）分析降解产物，进一步证实了酶对不同聚酯塑料的降解作用。
- 催化能力和热稳定性的分子机制：通过分子对接和分子动力学模拟，研究 SiCut1 和 SiCut2 与聚酯塑料底物的相互作用。结果表明，SiCut1 和 SiCut2 的催化三联体残基可对 PCL 三聚体的羰基碳原子进行亲核攻击，且 SiCut1 与 PCL 三聚体形成共价中间体的过程比 SiCut2 更可行，这可能是 SiCut1 对 PCL 催化活性更高的原因。此外，SiCut2 在高于 30°C 时热稳定性更好，这与其特定环区域（G121 - V126）结构刚性更高有关。
讨论
本研究从食塑黄粉虫肠道分离出聚酯降解酵母菌株 BIT - D3，鉴定出两种新型角质酶 SiCut1 和 SiCut2，它们的氨基酸序列与先前报道的角质酶相似度低，表明黄粉虫肠道微生物是发现新型聚酯降解角质酶的重要来源。
酵母菌株 BIT - D3 在以柠檬酸盐、丙酮酸盐或琥珀酸盐为额外碳源时可降解聚酯塑料，而以葡萄糖或乳糖为碳源时则不能。这可能是因为柠檬酸盐等可增强细胞能量代谢，激活聚酯降解酶相关表达途径；葡萄糖和乳糖可能诱导碳代谢物阻遏（CCR），抑制聚酯降解所需酶系统或代谢途径。在 SiCut1 和 SiCut2 编码基因的启动子区域发现 CCR 调控元件，提示其表达可能受 CCR 调节。
SiCut1 和 SiCut2 对不同聚酯塑料的降解活性与已知酵母来源角质酶不同，它们具有独特的 GYSKG 基序，可能导致活性位点构象改变，影响催化效率。未来可通过突变实验进一步验证这一假设。
SiCut1 催化活性高，SiCut2 热稳定性好，可通过结构域交换等酶工程策略构建嵌合蛋白，有望开发出高效、热稳定的塑料降解工程酶，推动塑料循环经济发展。
结论
酶促降解和回收是减轻塑料垃圾环境影响的有效策略，本研究发现的 SiCut1 和 SiCut2 是具有潜力的新型生物催化剂。未来可利用酶工程方法，基于 SiCut1 和 SiCut2 序列构建嵌合酶，为塑料降解和回收提供更高效的工具，促进塑料循环经济的发展。
材料和方法
- 测试材料：实验使用多种聚酯塑料，包括 PCL、PBS、PLA 等，介绍了塑料乳液和塑料薄膜的制备方法。
- 从食塑黄粉虫肠道分离酵母：详细描述了从黄粉虫肠道分离酵母的实验步骤，包括表面消毒、肠道处理、培养、稀释涂布、纯化以及菌种鉴定的方法。
- 评估酵母分离株的聚酯降解能力：通过在固体检测板上观察透明圈形成和在液体培养基中检测 PCL 降解活性，评估酵母对聚酯的降解能力，并利用 FTIR 光谱分析降解产物化学结构变化。
- 菌株 BIT - D3 的基因组和转录组测序：介绍了菌株 BIT - D3 基因组和转录组测序的实验流程，包括细胞培养、核酸提取、测序平台和数据分析方法。
- 在Pichia pastoris中重组表达蛋白：描述了在Pichia pastoris中重组表达 SiCut1 和 SiCut2 的实验步骤，包括 cDNA 合成、基因扩增、载体构建、转化、筛选以及蛋白表达和纯化的方法。
- 重组酶的生化特性分析：通过在不同 pH 和温度条件下进行酶活性和稳定性测试，包括标准酶活性测定、pH 稳定性测试、热稳定性测试和半衰期测定，分析重组酶的生化特性。
- 对p - 硝基苯酚酯、甘油三酯和角质的酶促测定：分别介绍了测定 SiCut1 和 SiCut2 对p - 硝基苯酚酯、甘油三酯和角质水解活性的实验方法，包括底物准备、反应条件、产物检测和数据分析。
- 对聚酯塑料的酶促测定：以多种聚酯塑料为底物，通过测定塑料薄膜降解前后的重量变化和利用 HPLC - MS 分析降解产物，评估酶对聚酯塑料的降解能力。
- 建模、分子对接和分子动力学模拟：利用 AlphaFold v2.0 预测 SiCut1 和 SiCut2 的三维结构，通过分子对接和分子动力学模拟研究酶与底物的相互作用机制，包括结构可视化、配体准备、对接和模拟参数设置以及结果分析。
