Pseudomonas protegens Pf-5中多炔化合物生物合成的双层级调控机制及其广谱抗菌活性研究

本研究发现土壤细菌Pseudomonas protegens Pf-5通过GacA-RsmE-PgnC信号通路实现多炔化合物（polyyne）的双层级调控：全局调控因子GacA通过解除RsmE对pgnC mRNA的翻译抑制，激活途径特异性转录调控因子PgnC，进而直接启动多炔生物合成基因簇表达。该研究首次阐明细菌多炔生产的分子机制，并证实其产物protegenins对革兰氏阳性（如Staphylococcus aureus）和阴性菌（如Pseudomonas syringae）均具显著抑制活性，为新型抗菌剂开发提供理论依据。

　　多炔化合物的生物合成调控机制
研究发现Pseudomonas protegens Pf-5通过独特的双层级调控网络精确控制多炔化合物protegenins的生物合成。位于基因簇内的途径特异性转录调控因子PgnC（AraC家族）被证实通过结合pgnD启动子区反向重复序列直接激活多炔生物合成基因表达。有趣的是，pgnC基因自身的表达受到全局调控系统GacS/GacA的严格调控，该机制涉及典型的小RNA-Rsm蛋白调控模块。

GacA-RsmE介导的翻译调控
通过构建pgnC翻译报告系统（pPgnC_translation:rfp），研究揭示GacA通过诱导rsmX/Y/Z小RNA表达，解除RsmE对pgnC mRNA 5'UTR区（含GGA结合基序）的翻译抑制。AlphaScreen实验直接证实RsmE蛋白与156bp的pgnC前导mRNA特异性结合，这种互作在10nM浓度时达到峰值。值得注意的是，gacA突变虽仅轻微降低pgnC转录水平，却使PgnC蛋白翻译效率下降达60%，说明该调控主要发生在翻译层面。

多炔化合物的广谱抗菌活性
通过构建六重突变体（ΔprnCΔphlDΔrzxBΔpltAΔhcnBΔofaA）和七重突变体（ΔpgnE或ΔpgnC），结合HPLC和LC-MS分析，研究确认protegenin A/C/D的产生与抗菌活性直接相关。抗菌实验显示，多炔产生菌对革兰氏阳性菌（Bacillus subtilis 168和Staphylococcus aureus ATCC 12600）及阴性菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000等）均产生明显抑制圈，而土壤来源菌株（如Pseudomonas putida KT2440）表现出天然耐受性。

代谢网络的协同调控
比较野生型与六重突变体发现，关闭其他抗生素途径（如吡咯硝素、2,4-二乙酰基间苯三酚等）使多炔产量提升3倍，暗示不同次级代谢途径间存在底物竞争。在P. fluorescens SBW25中的异源表达实验证实，PgnC可不依赖其他Pf-5特异性因子直接激活pgnD启动子，但该激活作用在E. coli等远缘菌种中失效，提示可能存在物种特异的辅助因子。

潜在应用价值
该研究首次绘制了从全局调控到途径特异性激活的多炔合成完整调控通路，为通过改造GacA-PgnC模块提高多炔产量奠定基础。发现的广谱抗菌活性（尤其对植物病原菌Xanthomonas translucens MW40等）为开发新型生物农药提供候选分子。研究还提出PFL_0259（毗邻pgnC的转运蛋白基因）可能参与自身抗性的假说，为后续机制研究指明方向。