探秘链霉菌调控密码：Sco4385 与 Sco3571 如何影响脂核苷抗生素异源合成

《Applied and Environmental Microbiology》：The TetR-like regulator Sco4385 and Crp-like regulator Sco3571 modulate heterologous production of antibiotics in Streptomyces coelicolor M512

本文聚焦链霉菌（Streptomyces），通过 DNA 亲和捕获分析（DACAs）结合质谱技术，发现 TetR 样调节因子 Sco4385 和 Crp 样调节因子 Sco3571 可调控脂核苷抗生素（如 caprazamycin、liposidomycin）的异源合成，为优化抗生素生产提供关键线索，极具科研价值。

　　### 研究背景
caprazamycins 是由链霉菌（Streptomyces）sp. MK730 - 62F2 天然产生的脂核苷抗生素，对结核分枝杆菌等有强抗菌活性，其半合成类似物 CPZEN - 45 已进入临床试验。caprazamycins 和 liposidomycins 结构和生物合成特征相似，基因簇遗传排列高度相似，相应启动子区域位置相同且 DNA 序列有一定同一性。此前研究发现宿主初级代谢与诺维霉素生物合成基因簇（BGC）存在 “串扰”，受调节因子调控。本研究旨在探究链霉菌（Streptomyces）coelicolor M512 对 caprazamycins 和 liposidomycins 异源表达基因簇的调控作用。

实验方法

1. 细菌培养与样本采集：培养大肠杆菌（E. coli）和链霉菌（Streptomyces）菌株，链霉菌（Streptomyces）菌株先在胰蛋白大豆肉汤（TSB）培养基预培养，再转接至生产培养基（PM）培养。培养过程中按时间点采集样本用于各项检测。
2. RNA 相关实验：从链霉菌（Streptomyces）coelicolor M512/cpzLK09 和 M512/lpmLK01 培养物中提取总 RNA，进行 DNA 酶消化、纯化后，检测 RNA 质量、构建文库并测序。对测序数据进行质量评估、比对和分析，计算基因计数、进行主成分分析（PCA）等。
3. 20 L 发酵实验：将链霉菌（Streptomyces）coelicolor M512/cpzLK09 和 M512/lpmLK01 在 20 L 发酵罐中培养，采集不同时间点样本，用于测定细胞干重、脂核苷产量、RNA 和蛋白质提取等。
4. DNA 亲和捕获分析（DACA）：扩增并生物素化 caprazamycin 和 liposidomycin 基因簇的启动子区域及阴性对照，与全细胞蛋白提取物孵育，捕获结合蛋白，经处理后用纳升级液相色谱 - 串联质谱（NanoLC - MS/MS）分析鉴定。
5. 基因过表达和基因敲除菌株构建：将相关基因克隆到载体构建过表达菌株，通过质粒介导的 CRISPR - Cas9 方法构建基因敲除菌株，筛选验证后用于后续实验。
6. 脂核苷提取与检测：培养过表达和基因敲除突变株，测定细胞干重，提取培养上清中的脂核苷，用高效液相色谱 - 电喷雾电离 - 质谱（HPLC - ESI - MS）检测产量。
7. 蛋白相关实验：表达纯化带有 His 标签的 Sco4385 蛋白，进行尺寸排阻色谱（SEC）和尺寸排阻色谱 - 多角度光散射（SEC - MALS）分析其多聚体状态。利用生物层干涉技术（BLI）检测 Sco4385 与 DNA 片段的结合情况。

实验结果

1. 启动子区域鉴定和转录组分析：确定 caprazamycin 和 liposidomycin 基因簇的 4 对相应推定启动子区域，转录组分析显示两个基因簇的操纵子结构相似，部分基因转录有差异，据此选择启动子区域用于 DACA 实验。
2. 结合蛋白鉴定：DACA 实验共捕获 2214 种蛋白，多数为非特异性结合。筛选出 3 种特异性结合相应启动子对的蛋白，包括 MarR 型调节因子 Sco2987 和 TetR 家族调节因子 Sco4385、Sco5956，还发现已知的 Crp 型调节因子 Sco3571 虽非特异性结合，但参与前体供应调控。
3. 基因过表达和敲除实验：过表达 Sco4385 显著提高 caprazamycin 产量，对 liposidomycin 产量无影响；过表达 Sco3571 使 caprazamycin 和 liposidomycin 产量均增加约三倍。敲除 Sco3571 使 caprazamycin 产量降低，对 liposidomycin 产量影响不确定；敲除 Sco4385 对两种抗生素产量均无显著影响。
4. Sco4385 结合位点确定：BLI 实验表明 Sco4385 在 P_cpz10和 P_lpmH的不同位置有结合，在 P_cpz10的 1 和 4 段、P_lpmH的 1、7 和 8 段结合明显。通过分析确定一个 23 bp 的共有序列，实验验证部分序列可被 Sco4385 识别结合。

讨论

本研究通过 DACA 和质谱技术，发现新调节因子 Sco4385 影响 caprazamycin 生产，其在不同基因簇启动子区域结合位置不同，可能导致对两种抗生素产量的不同影响，表明同一调节蛋白对相似 BGCs 的调控存在差异，每个异源表达基因簇的调控都需单独研究。Sco3571 通过调节前体供应提高抗生素产量，在不同菌株中高度保守，其调控机制可能适用于天然生产菌株。本研究为优化菌株提高天然产物产量提供了重要参考，揭示了宿主调节因子与异源表达基因簇的相互作用关系。