单引导RNA Cas9与增强缺失Cas9协同修复USH2A基因常见剪接缺陷的机制研究

本研究创新性采用单引导RNA（sgRNA）结合Cas9或TREX2融合增强型Cas9（EDCas9）基因编辑系统，成功修复USH2A基因c.7595-2144A>G深内含子变异引发的剪接缺陷。通过迷你基因模型和患者源性成纤维细胞实验证实，EDCas9能产生更大规模定向缺失，稳定破坏异常剪接信号，且具有更优的安全性和避免染色体易位特性。病毒样颗粒（VLP）递送系统的验证为临床转化提供新思路，为遗传性视网膜病变治疗开辟新途径。

　　

研究背景与意义

遗传性疾病的剪接缺陷是重要致病机制，尤其深内含子变异导致的伪外显子（PE）激活在USH2A基因相关视网膜病变中占比显著。传统反义寡核苷酸（ASO）疗法需反复给药，而双引导RNA（gRNA）CRISPR-Cas9策略存在多重双链断裂（DSB）的基因毒性风险。本研究聚焦USH2A基因c.7595-2144A>G变异——该变异通过激活152bp的PE40插入导致蛋白截短，在Usher综合征和单纯性视网膜色素变性患者中占比达4%。

创新性方法设计

研究团队设计六种靶向PE40关键区域的sgRNA：gRNA1靶向隐蔽剪接受体上游，gRNA2-6覆盖隐蔽供体位点及变异位点。通过将Cas9与3'→5'核酸外切酶TREX2融合构建EDCas9系统，利用其非对称DNA末端处理特性，使缺失偏向非靶链3'端延伸。迷你基因实验显示，EDCas9组剪接修复效率（88.0%±1.9%）显著高于传统Cas9（71.8%±30.0%），且实验重复性更优（标准差1.9%-15.2% vs 10.4%-30%）。

细胞模型验证

在患者纯合成纤维细胞中，EDCas9介导的gRNA1/3/5/6均实现>85%剪接修复。纳米孔测序揭示EDCas9产生100-400bp定向缺失，而Cas9仅诱导小片段缺失。值得注意的是，gRNA6/Cas9在成纤维细胞中意外产生140bp缺失（覆盖整个PE区域），但在HEK293T中未出现，提示细胞类型特异性修复模式。

安全性评估

GUIDE-seq分析显示gRNA3/6无脱靶活性。染色体易位实验证实EDCas9可完全避免Cas9引发的易位事件（如USH2A-LPA融合）。等位基因特异性分析显示gRNA6对突变等位基因编辑偏好性达90.1%，且VLP递送RNP复合物时仍保持36%±3%的编辑效率，未检测到载体DNA残留导致的误编辑。

机制与转化价值

研究阐明EDCas9通过三重机制提升疗效：增强缺失规模破坏剪接信号、减少插入突变、降低染色体不稳定性。相较于需双gRNA的PE切除策略，单sgRNA方案将DSB数量减半，且EDCas9特有的DNA末端"锚定-降解"机制使缺失范围可控。病毒样颗粒递送系统的成功验证为视网膜等终末分化组织的基因治疗提供潜在解决方案。

临床展望

该研究为USH2A相关眼病提供首个单sgRNA编辑方案，其82.7%的平均剪接修复率优于既往ASO疗效（约60%）。未来需在类器官和动物模型中验证长期安全性，并优化VLP的视网膜靶向性。该策略可扩展至CEP290、ABCA4等其他基因的深内含子变异修复，为遗传性疾病的永久性基因组矫正树立新范式。