质子感知蛋白 TRIM25 对外源 RNA 的监测机制：解锁 mRNA 疗法优化新密码

《SCIENCE》：Exogenous RNA surveillance by proton-sensing TRIM25

为探究外源性信使核糖核酸（mRNA）的调控机制，研究人员开展了基于脂质纳米颗粒（LNP）包裹的体外转录 mRNA 的全基因组 CRISPR 筛选研究。结果发现硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）等参与 LNP 摄取等过程，TRIM25 可抑制 mRNA，N1- 甲基假尿苷修饰能逃避其抑制。该研究为 RNA 免疫和疗法提供新思路。

　　外源性核糖核酸（RNAs），包括治疗性信使核糖核酸（mRNAs）和病毒核糖核酸，要进入细胞并合成蛋白质，必须突破细胞的重重屏障和防御。目前临床使用的 mRNA 技术借助可电离脂质纳米颗粒（LNPs）递送体外转录（IVT）的 mRNA，这些 mRNA 带有 5′ 帽结构、聚腺苷酸（poly (A)）尾，以及 N¹- 甲基假尿苷（m¹Ψ）修饰，这些结构能增强蛋白质的合成能力。LNP 中的可电离脂质在内涵体酸化后会带上正电荷，促使内涵体破裂，将 mRNA 释放到细胞质中。这些创新极大地提升了转基因表达水平，让 mRNA 成为了极具变革性的治疗平台。然而，尽管 LNP-mRNA 应用广泛，但其调控机制却仍未完全明晰。深入了解外源性 RNA 生命周期的细胞过程，对推动 mRNA 疗法的发展至关重要。

为了系统地找出细胞调控因子，研究人员进行了全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选实验。他们将单导向 RNA（sgRNA）文库导入 HCT116 细胞，随后转染编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的 mRNA。这些 IVT mRNA 在合成时，分为含有 m¹Ψ 和不含 m¹Ψ 两种类型，以此来探究 m¹Ψ 修饰是如何提高蛋白质产量的。同时，研究人员还利用稳定表达 EGFP 的细胞系进行了反向筛选，以区分调控内源性和外源性 mRNA 的因子。通过荧光激活细胞分选技术，研究人员分离出荧光强度最低和最高的细胞，再对富集的 sgRNA 进行测序，分别找出正向和负向调控因子。

从 IVT mRNA 的筛选实验中，研究人员发现了一些正向调控因子，其中包括参与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）合成的基因、囊泡运输相关基因，以及液泡型腺苷三磷酸酶（V-ATPase）的亚基。HSPGs 是细胞表面的糖蛋白，带有共价连接的硫酸乙酰肝素链，干扰 HSPGs 会减少 mRNA 的内化，表明它们在 LNP 摄取过程中发挥着重要作用。V-ATPase 是一种质子泵，能使内涵体酸化，敲低或抑制 V-ATPase 会阻碍 LNP-mRNA 从内涵体中逃逸。

筛选实验还发现，RNA 结合的 E3 泛素连接酶 TRIM25 是关键的细胞质抑制因子。敲除或敲低 TRIM25 会使 LNP-mRNA 的基因表达增加。TRIM25 在多种人类和小鼠细胞类型中都发挥作用，说明这是一种广泛存在且保守的监测机制。TRIM25 通过诱导 RNA 降解发挥作用，对翻译过程和去腺苷酸化影响较小。它不仅能下调线性 RNA，还能下调环状 RNA，这表明其作用机制可能是内切核糖核酸酶的作用方式。研究人员还发现，两种含有 NYN 结构域的内切核糖核酸酶 N4BP1 和 KHNYN，与锌指抗病毒蛋白（ZAP）一起，以 TRIM25 依赖的方式作为 RNA 降解因子发挥作用。m¹Ψ 修饰会降低 TRIM25 与 RNA 的结合能力和泛素化活性，有助于 RNA 逃避 TRIM25 的抑制作用。TRIM25 对 RNA 序列、帽结构或 poly (A) 尾长度没有特异性偏好，而是专门针对酸化内涵体递送的外源 RNA 发挥作用。即使在弱酸性 pH 条件下，TRIM25 与 RNA 的结合亲和力也会增强，这表明它可能被破裂内涵体释放的质子激活。

这项研究明确了 HSPGs、V-ATPase 和 TRIM25 等关键因子，阐明了调控 LNP-mRNA 递送和稳定性的细胞机制。研究人员对细胞通路的全面解析，为 RNA 免疫和治疗学提供了新的见解。m¹Ψ 修饰降低了 TRIM25 与 RNA 的结合能力，减轻了 TRIM25 的抑制作用，这也解释了为什么 m¹Ψ 能有效提升 IVT mRNA 的性能。值得注意的是，TRIM25 专门识别通过内吞途径进入细胞质的外源 RNA，而且其 RNA 结合亲和力会随着 pH 的微小变化而增强。研究结果提出了一种模型，即 TRIM25 会被酸化内涵体释放的质子局部激活，从而能够选择性地识别非自身 RNA。这表明 TRIM25 就像是一个质子感知的 “卫士”，能对内涵体损伤做出反应，同时也揭示了质子作为信号分子的重要作用。