双棱镜介导的脑干细胞分辨率成像技术：揭示迷走神经-孤束核通路在情绪调控中的关键作用

本研究开发了一种创新的双棱镜光学界面技术（D-PSCAN），实现了对深部脑干区域（特别是孤束核NTS）的微创、宽视野双光子成像。该技术突破传统方法需移除小脑的限制，在保留周围神经结构完整性的同时，以细胞分辨率捕捉NTS神经元对迷走神经刺激（VNS）和胃肠激素CCK-8的响应特征，为阐明脑-内脏通讯的神经机制及VNS治疗神经精神疾病（如癫痫、抑郁症）的优化参数提供重要工具。

　　

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双棱镜技术突破脑干成像瓶颈

传统光学技术难以观测深部脑区如脑干的神经活动，尤其当目标区域被小脑覆盖时。本研究创新性地采用双微棱镜组装体（2mm直角棱镜×2），通过真空吸附装置将其植入小脑与脑干间隙，建立光学通路。该系统在保持小脑结构完整的前提下，实现2×2mm宽视野成像，轴向分辨率34μm，横向分辨率2.3μm，可清晰区分相距40-150μm的NTS与迷走神经运动背核（10N）。

特异性验证与空间分辨率

通过荧光微珠实验证实，4mm玻璃光路的双棱镜未显著降低成像质量。免疫染色显示GCaMP表达严格限于ChAT阴性的NTS神经元，而迷走神经感觉神经元所在的结状节信号强度仅为NTS的1/5，有效排除逆向标记干扰。体积成像（11-16个z平面，0.4-1.0Hz/体积）结合约束非负矩阵分解算法，成功解析轴向重叠的神经元活动。

NTS对迷走神经刺激的动态响应

在1.0mA/10Hz的VNS参数下（100μs脉宽），NTS神经元呈现三类响应模式：瞬时激活型（潜伏期<2s）、持续激活型和抑制型。值得注意的是，相同刺激条件下，邻近AP区域的神经元反应强度较NTS降低63%（p<0.01），证实响应特异性。高频刺激（20Hz）诱发更强烈的钙瞬变，但伴随更快的适应性衰减。

胃肠激素CCK-8的神经编码特征

作为生理性刺激，CCK-8（5μg/kg腹腔注射）激活的NTS神经元群体与VNS响应群体存在32%的重叠。有趣的是，这些共激活神经元对两种刺激呈现相似的时间动力学（τ=1.8±0.3s），但CCK-8特异性神经元表现出更持久的后放电（>30s），提示内脏信号在NTS的并行处理机制。

技术优势与转化价值

相比传统小脑切除法，D-PSCAN完整保留小脑-脑干连接，这对研究情绪相关神经环路至关重要。该方法已成功应用于优化VNS治疗参数：0.5-1.0mA电流配合5-10Hz频率可最大化NTS激活率（78±6%）而避免过度抑制。这些发现为开发精准神经调控疗法提供新思路，特别是对耐药性癫痫和难治性抑郁症的个体化治疗。