揭开 GLUT9 转运尿酸的神秘面纱：结构基础与潜在治疗新靶点

《Cell Reports》：Structural basis of urate transport by glucose transporter 9

本文聚焦葡萄糖转运蛋白 9（GLUT9），通过冷冻电镜解析其 apo 和尿酸结合状态的结构，发现其独特的尿酸识别方式。这一研究为理解尿酸代谢机制提供依据，也为开发针对 GLUT9 的降尿酸药物带来新希望，极具科研与临床价值。

　　

研究背景

尿酸（urate）是人类嘌呤代谢的终产物，在体内主要以尿酸盐的形式存在。人体缺乏尿酸降解酶尿酸氧化酶（uricase，UOX），因此尿酸盐转运蛋白对血清尿酸水平的调节至关重要。在人体中，三分之二的尿酸经尿液排出，而肾脏近端小管会重吸收大部分滤过的尿酸，这一过程主要由尿酸盐转运蛋白 1（URAT1/SLC22A12）和葡萄糖转运蛋白 9（GLUT9/SLC2A9）协同完成。GLUT9 有两种剪接异构体 GLUT9S 和 GLUT9L，其中 GLUT9L 是主要异构体，与 URAT1 共同将尿酸从原尿重吸收至血液。

遗传功能异常的 URAT1 和 GLUT9 分别与 I 型和 II 型肾性低尿酸血症（RHUC）相关，表明它们在尿酸调节中的重要生理作用。目前降低血清尿酸的药物主要是促尿酸排泄剂，如丙磺舒、苯溴马隆和雷西纳德等，这些药物主要抑制 URAT1，部分药物（如苯溴马隆）也能抑制 GLUT9，但尚无 GLUT9 选择性抑制剂上市。

GLUT9 属于 GLUT 家族，该家族有 14 个成员，基于序列相似性分为三类。GLUT9 虽属于 II 类亚家族，但与其他成员相比，对葡萄糖和葡萄糖类似物亲和力较低。此前虽有对糖转运成员结构机制的研究，但对非糖转运成员（如 GLUT9）的机制了解甚少，其尿酸偏好的分子基础也不清楚。

研究结果

1. GLUT9 的功能和结构表征：通过在 HEK293A 细胞中瞬时表达 GLUT9 的两种异构体，评估放射性标记的 [8-¹⁴C]- 尿酸的细胞摄取情况，发现两种异构体均有显著的尿酸摄取活性，且 GLUT9 介导的尿酸摄取不受常用 GLUT 抑制剂细胞松弛素 B 的抑制，但能被苯溴马隆显著抑制，验证了实验系统评估 GLUT9 介导尿酸转运的有效性。

在结构研究方面，通过在 HEK293-F 细胞中过表达 GLUT9 并纯化，进行冷冻电镜（cryo-EM）分析，成功确定了 apo 和尿酸结合状态下 GLUT9 的结构，分辨率分别为 3.1 ? 和 3.4 ?。2. 尿酸结合的 GLUT9 内向开放结构：GLUT9 与其他 GLUT 成员一样，具有 12 个跨膜螺旋（TM1 - 12），TM1 - 6 形成 N 端结构域（NTD），TM7 - 12 形成 C 端结构域（CTD）。在细胞内，胞质环形成细胞内螺旋结构域（ICH1 - 5）；在细胞外，TM1 的延伸环形成带有 N90 糖基化位点的螺旋（TM1e）。尿酸分子结合在 NTD 和 CTD 之间朝向细胞质广泛开放的裂隙中，通过氢键和疏水相互作用与 GLUT9 结合。3. GLUT9 与 I 类和 II 类 GLUTs 的比较：将 GLUT9 的结构与其他 GLUTs 的结构进行比较，发现 GLUT9 与结合 n - 壬基 -β-D - 吡喃葡萄糖苷（β-NG）的 GLUT1 内向构象最为相似，但在底物识别口袋的氨基酸组成上存在差异，这些差异可能解释了 GLUT9 识别尿酸的底物特异性。与转运果糖的 GLUT5 相比，GLUT9 也有独特的氨基酸组成，表明其与糖转运 GLUTs 的差异。4. 突变分析：为研究尿酸识别残基的功能，对 GLUT9 进行突变分析。对 Y71、Y327、W336 和 E364 等四个独特残基进行单突变和多突变，发现单个突变体仍保留尿酸转运活性，而多个突变体（如 Y327Q/W336F/E364N 和 Y71F/Y327Q/W336F/E364N）显著降低转运活性，且不影响蛋白在细胞表面的定位和表达水平，说明这些关键残基的集体作用对尿酸识别至关重要。5. GLUT9 转运尿酸的机制：比较本研究中 GLUT9 的结构与先前报道的尿酸和芹菜素结合结构，发现尿酸或抑制剂结合可稳定 NTD 和 CTD。通过 AlphaFold2 生成 GLUT9 的结构集合并进行主成分分析，发现 GLUT9 可能遵循与其他 GLUT 成员类似的交替访问机制，即通过 ICH 残基（如 R198、R257、R447 和 Y507）形成细胞内门，在不同构象间转换来实现尿酸转运。6. II 型肾性低尿酸血症相关突变的定位：超过十二个与 II 型肾性低尿酸血症相关的 GLUT9 非同义突变已被鉴定。将这些突变映射到 GLUT9 结构上，发现部分突变（如 L75R、C210F 和 N333S）位于 NTD 和 CTD 的界面，靠近尿酸结合位点，影响尿酸亲和力或蛋白折叠；一些突变（如 R198C 和 R380W）位于 ICH，影响 GLUT9 的交替访问，进而降低尿酸转运活性。

研究讨论

本研究揭示了 GLUT9 结合和未结合尿酸的冷冻电镜结构，以及其独特的尿酸识别方式。改变 GLUT9 中识别尿酸的一两个残基为 GLUT1 中的相应残基，不影响 GLUT9 介导的尿酸转运，说明 GLUT9 中不存在对尿酸识别起关键作用的单一相互作用。

目前关于 GLUT9 结构和尿酸识别的信息有助于设计 GLUT9 选择性抑制剂用于降低血清尿酸治疗。虽然已有 URAT1 选择性抑制剂用于临床，但尚无 GLUT9 特异性抑制剂。研究还发现，已知的促尿酸排泄剂中，只有苯溴马隆能显著抑制 GLUT9 的尿酸转运活性，但尝试对 GLUT9 与苯溴马隆复合物进行冷冻电镜分析仅得到 apo 结构，推测苯溴马隆可能作为外表面抑制剂优先结合 GLUT9 的外向开放构象，而在实验条件下 GLUT9 在十二烷基麦芽糖新戊二醇（LMNG）胶束中稳定在内向开放构象，无法结合外表面抑制剂。

此外，本研究强调了 GLUT 家族的结构多样性。GLUT9 的尿酸结合结构和序列比对表明，II 类和 III 类成员的底物结合位点氨基酸组成比 I 类成员更具差异，这可能使它们能够识别非糖物质作为转运底物，同时共享相似的交替访问机制，如 GLUT12 可转运尿酸和抗坏血酸。因此，GLUT9 的结构和突变分析为理解非传统 GLUT 成员如何识别非糖底物提供了起点。

研究局限性

本研究结果与近期一项关于 GLUT9 的报告存在差异。该报告通过膜片钳分析在细胞外低 pH 条件下（pH 5.5）1 mM 尿酸时的净电荷运动，发现底物口袋中每个丙氨酸突变几乎消除了尿酸转运活性。本研究生成相同的九个丙氨酸突变体，在低 pH 和标准 pH 7.4 条件下直接测量尿酸转运，结果显示除 V213A 在低 pH 条件下有适度降低外，其他突变体的尿酸转运活性在两种条件下均保持不变。这种差异表明尿酸介导的电流和实际尿酸摄取可能存在差异，需要进一步研究来解决这一不一致性。