CRISPRi 技术揭示 ADNP 基因在小胶质细胞中的关键作用：为自闭症研究开辟新路径

《Molecular Psychiatry》：CRISPRi-based screen of autism spectrum disorder risk genes in microglia uncovers roles of ADNP in microglia endocytosis and synaptic pruning

自闭症谱系障碍（ASD）的发病机制复杂，多数研究聚焦神经元中风险基因，小胶质细胞中相关基因作用不明。研究人员运用 CRISPRi 技术筛选 ASD 风险基因，发现 ADNP 影响小胶质细胞内吞、突触修剪等过程。这为理解 ASD 发病机制提供新视角，有助于开发潜在治疗靶点。

　　在神经科学的神秘领域中，自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorders，ASD）一直是一道难以攻克的谜题。这是一组复杂的神经发育障碍，患者常伴有社交和沟通障碍、重复刻板行为等症状。尽管环境和遗传因素都与 ASD 的发病风险相关，但大脑发育异常的具体机制仍不明确，尤其是小胶质细胞在其中的作用。小胶质细胞作为大脑中的常驻免疫细胞，不仅承担着免疫调节的重任，还在神经回路发育过程中发挥着关键作用，如清除凋亡的神经祖细胞、参与突触重塑以及调节神经元活动等 。然而，在 ASD 患者中，小胶质细胞呈现出异常激活状态，但我们并不清楚这是对异常神经元信号的反应，还是小胶质细胞自身的内在状态改变所致。

同时，随着基因组测序和从头突变分析技术的发展，虽然已经鉴定出了许多与 ASD 风险相关的基因，但大多数功能基因组学研究主要集中在这些基因在神经元和神经祖细胞中的作用，对于它们在小胶质细胞中的功能却知之甚少。在这样的背景下，来自美国加利福尼亚大学旧金山分校（University of California, San Francisco）的研究人员展开了一项意义重大的研究，其成果发表在《Molecular Psychiatry》杂志上，为我们深入理解 ASD 的发病机制带来了新的曙光。

研究人员为了探索 ASD 风险基因在小胶质细胞中的功能，采用了多种关键技术方法。首先，利用 CRISPRi（CRISPR interference）技术，通过慢病毒将靶向特定基因的 sgRNA 导入诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），实现对基因表达的部分抑制，模拟杂合性功能丧失的状态。其次，建立了 iPSC 衍生的小胶质细胞 - 神经元共培养系统，结合高通量流式细胞术，用于监测小胶质细胞对突触物质的摄取，即突触修剪过程。此外，运用单细胞测序（Single cell sequencing）、蛋白质组学（Proteomics）等技术，从转录组和蛋白质组水平深入分析小胶质细胞在基因敲低后的变化。

下面来看具体的研究结果：

1. 部分 ASD 风险基因在小胶质细胞中表达并影响其激活状态：研究人员通过分析已发表的人类单细胞测序数据集，发现部分 ASD 风险基因在小胶质细胞中有一定表达。利用 CROP - Seq（CRISPR droplet sequencing）技术对 53 个在小胶质细胞中高表达的 ASD 风险基因进行 CRISPRi 介导的基因敲低实验，结果显示，许多 ASD 风险基因的敲低改变了小胶质细胞的激活状态，如 ADNP、AP2S1 等基因的敲低影响了小胶质细胞的转录组状态分布12。
2. 开发高通量体外突触修剪检测方法：为了研究 ASD 风险基因在小胶质细胞突触修剪中的作用，研究人员开发了一种基于流式细胞术的高通量检测方法。他们构建了表达突触素 - Gamillus 融合蛋白的神经元和表达核蓝色荧光蛋白的小胶质细胞共培养体系，通过检测小胶质细胞摄取突触素 - Gamillus 的绿色荧光强度来衡量突触修剪水平。实验证明，该方法具有较高的特异性和可靠性，能够有效检测小胶质细胞对突触物质的摄取34。
3. ADNP 是小胶质细胞突触修剪的独特遗传调节因子：通过对 102 个 ASD 风险基因进行基于 CRISPRi 的吞噬作用筛选，研究人员发现 ADNP 基因敲低特异性地增加了小胶质细胞对活突触物质的摄取。与其他基因敲低相比，ADNP 敲低导致小胶质细胞的干扰素激活状态显著降低，增殖激活状态增加56。
4. ADNP 敲低影响小胶质细胞蛋白质组和与神经元的相互作用：对 ADNP 敲低的小胶质细胞进行表面蛋白质组学和全细胞蛋白质组学分析，发现许多与细胞运动、内吞作用和突触修剪相关的蛋白质表达发生变化。同时，ADNP 敲低的小胶质细胞在与神经元共培养时，运动能力增强，监测区域增大，但对突触小体的吞噬作用未发生改变，表明 ADNP 敲低特异性地影响了小胶质细胞与活神经元和突触的相互作用78。
5. ADNP 敲低影响小胶质细胞内吞 trafficking：研究发现 ADNP 敲低导致小胶质细胞内吞酸化减少，酸性囊泡数量降低，同时 TREM2（Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2）等蛋白的分泌增加。这些结果表明 ADNP 敲低影响了小胶质细胞的内吞 trafficking、表面蛋白质组和分泌组910。
6. ADNP 在小胶质细胞中的定位：免疫荧光实验显示，ADNP 在小胶质细胞中的定位与神经元不同，主要定位于胞质中的早期内吞小体，与网格蛋白和早期内体标记物共定位，提示 ADNP 可能在小胶质细胞内吞过程中发挥直接作用1112。
7. 人类患者数据中的内吞作用改变：对 ASD 患者和神经典型对照的原代人类小胶质细胞进行通路富集分析，发现 ASD 患者小胶质细胞中内吞体相关通路显著上调，这表明内吞体通路的改变可能是 ASD 患者的一个共同特征，不仅仅与 ADNP 功能丧失有关1314。

综合以上研究，研究人员得出结论：利用 CRISPRi 技术对 ASD 风险基因进行筛选，发现 ADNP 在小胶质细胞的内吞作用、突触修剪以及与神经元的相互作用中发挥着重要作用。ADNP 敲低导致小胶质细胞的内吞 trafficking 异常、蛋白质组重塑、运动能力增强以及突触修剪增加。此外，研究还发现小胶质细胞中 ADNP 的定位与神经元不同，且在人类 ASD 患者小胶质细胞中存在内吞体通路的改变。

这项研究具有重要意义。它首次系统地评估了 ASD 风险基因在小胶质细胞中的功能，为理解 ASD 的发病机制提供了新的视角。研究结果表明，小胶质细胞中 ASD 风险基因的功能异常可能是导致 ASD 神经发育异常的重要因素之一。同时，研究中开发的高通量检测方法和发现的关键基因 ADNP，为未来开发针对 ASD 的治疗策略提供了潜在的靶点和研究方向。然而，该研究也存在一些局限性，如使用的 iPSC 衍生的小胶质细胞与体内小胶质细胞存在差异，体外共培养系统中突触修剪的生理相关性尚不明确，以及 CROP - Seq 数据集的细胞数量有限等。但总体而言，这项研究为自闭症谱系障碍的研究开辟了新的道路，有望推动相关领域的进一步发展。