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为探究 CDK5RAP3 在神经元中的精确作用，研究人员构建 CDK5RAP3 条件性敲除（CKO）小鼠模型开展研究。结果发现 CDK5RAP3 缺失导致小鼠脑发育异常、神经元死亡等，该研究为早期脑部异常疾病的药物研发提供新方向。
在生命的奇妙旅程中，大脑的正常发育至关重要。N - 糖基化作为一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰，在神经发育中起着关键作用，它影响着神经纤维形成和神经递质分泌。一旦 N - 糖基化出现异常，无论是过多还是过少，都可能引发各种脑部疾病，比如在阿尔茨海默病中，就存在 N - 糖基化相关的异常。而 CDK5RAP3，作为 CDK5 激活蛋白的结合蛋白以及 UFMylation 系统中 E3 酶的关键辅助因子，其在神经元中的具体作用却一直是个谜。虽然已知 CDK5 和 UFMylation 系统的其他成分与神经元发育和多种精神疾病有关，但 CDK5RAP3 对大脑发育和功能的影响仍不明确。在这样的背景下，南京农业大学等机构的研究人员决心揭开这个谜团，他们开展了关于神经元中 CDK5RAP3 作用的研究，相关成果发表在《Cell Death Discovery》上。这一研究对于深入理解神经发育机制，以及为脑部疾病寻找潜在治疗靶点意义重大。
研究人员在这项研究中，主要运用了基因工程技术构建特定基因敲除小鼠模型、转录组测序分析基因表达变化、蛋白质免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达水平、免疫组化和免疫荧光染色观察组织和细胞内蛋白定位与表达情况等技术方法。通过这些技术，他们对小鼠的神经发育相关指标进行了全面深入的探究。
研究结果如下：
- CDK5RAP3 在小鼠脑部的表达分布：通过免疫组化（IHC）染色发现，CDK5RAP3 在小鼠大脑的多个区域，如海马体、大脑皮层、脉络丛等都有表达，其中在海马体、大脑皮层和脉络丛的表达水平较高。这暗示着 CDK5RAP3 可能在这些脑区发挥着重要作用。
- CDK5RAP3 缺失对小鼠生长发育的影响：构建神经元特异性 CDK5RAP3 条件性敲除（CKO）小鼠模型后发现，CKO 小鼠在出生后 14 天内逐渐死亡，出现生长发育迟缓、吸吮困难和运动障碍等症状。这表明神经元中 CDK5RAP3 的缺失严重影响了小鼠的正常生长发育。
- CDK5RAP3 缺失对大脑结构和神经元的影响：免疫荧光染色、H&E 染色和 TUNEL 染色结果显示，CKO 小鼠的大脑结构出现异常，海马体和大脑皮层区域的 CDK5RAP3 和 NeuN（一种神经元标记蛋白）表达降低，大脑皮层厚度变薄，海马体体积减小，神经元数量显著减少，同时 TUNEL 阳性细胞增多，这意味着神经元死亡增加。这些结果说明 CDK5RAP3 缺失导致了大脑结构异常和神经元大量死亡。
- CDK5RAP3 缺失对谷氨酸神经递质转运的影响：对 CKO 小鼠和野生型（WT）小鼠进行 mRNA - seq 分析，发现差异表达基因（DEGs）主要集中在与 “突触”“神经系统发育”“突触调节” 和 “跨膜转运” 等相关的过程中。进一步研究发现，CKO 小鼠中 SLC17A6 表达上调，GAD1 在 CA1 区域表达下调，这表明 CDK5RAP3 缺失影响了谷氨酸神经递质的转运，进而可能导致运动障碍。
- CDK5RAP3 缺失对小鼠脑组织内质网应激和 N - 糖基化酶沉积的影响：KEGG 分析显示，CKO 小鼠在 “溶酶体”“内质网（ER）中的蛋白质加工”“心肌细胞的肾上腺素能信号传导” 和 “N - 聚糖生物合成” 等通路存在失调。CKO 小鼠脑内 ER 应激相关蛋白 GRP78 和 XBP1s表达上调，N - 糖基化酶 RPN1 和 ALG2 蛋白水平显著增加，且 SLC17A6 可能受到 N - 糖基化酶的影响。这说明 CDK5RAP3 缺失引发了内质网应激和 N - 糖基化酶沉积。
- CDK5RAP3 缺失对胚胎成纤维细胞（MEFs）的影响：在 MEFs 中敲除 CDK5RAP3 后，发现 GRP78、Chop 和 Caspase - 12 等蛋白水平以及 ATF4、GRP78 和 CHOP 的 mRNA 表达均上调，同时 RPN1 和 ALG2 的蛋白和 mRNA 表达也增加。用毒胡萝卜素（TG）诱导 ER 应激后发现，ALG2 蛋白表达显著增加，这表明 CDK5RAP3 缺失诱导了 MEFs 中的 ER 应激和 N - 糖基化酶水平增加，且部分是由 ER 应激诱导的。
- CDK5RAP3 缺失对糖蛋白和糖原沉积的影响：PAS 染色显示，CKO 小鼠脑切片的视神经层和海马伞边缘神经束出现明显的糖原沉积，且 CKO 小鼠 MEFs 中糖蛋白总量显著增加。这说明 CDK5RAP3 缺失导致了糖蛋白和糖原沉积增加。
- CDK5RAP3 参与 N - 糖基化酶的蛋白酶降解和自噬：用自噬抑制剂 3 - 甲基腺嘌呤（3 - MA）处理 MEFs 后发现，CDK5RAP3 敲除 MEFs 中 RPN1 和 ALG2 蛋白水平未上调；用环己酰亚胺（CHX）抑制蛋白合成后发现，CDK5RAP3 敲除 MEFs 中 RPN1 和 ALG2 的蛋白酶降解减少，稳定性增加。这表明 CDK5RAP3 可能通过促进蛋白酶降解和自噬来维持 N - 糖基化酶的平衡。
研究结论和讨论部分指出，神经元中 CDK5RAP3 的缺失会导致小鼠在哺乳期出现脑发育异常和死亡。CDK5RAP3 在调节细胞内蛋白质 N - 糖基化中起着关键作用，它可能通过维持内质网稳态来调节正常的大脑发育，同时也可能通过影响 CDK5 的活性来调节与突触相关的基因表达。此外，CDK5RAP3 的缺失可能导致 SLC17A6 表达增加，进而影响谷氨酸神经递质的转运和神经元活性。该研究还发现 CDK5RAP3 缺失会导致神经元死亡增加，这可能与内质网应激和 N - 糖基化酶上调有关。虽然目前对于 CDK5RAP3 通过内质网应激、UFMylation 或自噬影响 N - 糖基化酶蛋白水平的分子机制尚未完全明确，但这项研究证实了 CDK5RAP3 在动物出生后脑发育中的不可或缺的作用，为早期脑部疾病提供了新的治疗靶点，为后续相关研究指明了方向，有望推动神经发育相关疾病治疗手段的进一步发展。
