呼吸道致敏原的前瞻性识别：基于气液界面模型的支气管上皮细胞研究揭示piperazine、chloramine-T和TDI的差异效应

《Archives of Toxicology》：Towards prospective identification of respiratory sensitizers: effects of piperazine, chloramine-T, and toluene-diisocyanate in an air–liquid interface model comprising human bronchial epithelial cells

本研究针对职业性哮喘的主要诱因——呼吸道致敏原(RSs)缺乏OECD认可测试指南的现状，荷兰国家公共卫生与环境研究所团队通过气液界面(ALI)模型，首次系统比较了piperazine、chloramine-T和TDI三种致敏原对人支气管上皮细胞Calu-3的影响。研究发现piperazine通过剂量依赖性增加IL-6分泌激活KE2关键事件，TDI主要破坏上皮屏障功能，而chloramine-T作用机制独特。该研究为构建基于AOP框架的非动物测试策略提供了重要数据支撑，发表于《Archives of Toxicology》。

　　职业性哮喘作为全球范围内严重的公共卫生问题，其罪魁祸首——呼吸道致敏原(Respiratory Sensitizers, RSs)的识别却面临尴尬局面：尽管已知piperazine、氯胺-T(chloramine-T)和甲苯二异氰酸酯(2,4-toluene-diisocyanate, TDI)等化学物质会导致呼吸道致敏，但国际经合组织(OECD)至今未批准任何用于前瞻性识别RSs的测试指南。更棘手的是，随着动物实验替代方法的推进，如何基于人类相关模型建立可靠的体外评估体系成为学界焦点。荷兰国家公共卫生与环境研究所的Evert Duistermaat团队独辟蹊径，将目光投向了呼吸道致敏不良结局通路(Adverse Outcome Pathway, AOP)中的关键事件2(KE2)——肺上皮细胞活化。

研究团队选择人支气管上皮细胞系Calu-3构建气液界面(Air-Liquid Interface, ALI)模型，这种创新设计不仅模拟了人体真实的暴露环境，还能避免培养液对化学物质活性的干扰。通过精密设计的暴露系统，研究人员让细胞分别接触三种典型RSs的气相状态：piperazine（3-100 mg/m³）、chloramine-T（30-3000 ng/cm²）和TDI（10-100 mg/m³），每日2小时连续3天。检测指标涵盖上皮屏障完整性（TEER）、细胞代谢（WST-1）、细胞毒性（LDH）以及IL-6、IL-8等炎症因子分泌。

关键技术包括：1）采用VITROCELL?模块化暴露系统实现气相化学物质精准给药；2）通过石英晶体微天平(QCM)实时监测气溶胶沉积量；3）结合ELISA和LEGENDplex?多因子检测全面解析细胞因子谱；4）运用PROAST软件进行基准剂量(BMD)建模。

研究结果揭示三类RSs呈现截然不同的作用模式：

1. Piperazine组：在87.9-99.1 mg/m³暴露浓度下，IL-6分泌呈现显著剂量依赖性增加（ apical侧浓度达basolateral侧的20倍），而TEER、LDH等指标未见异常。BMD分析显示诱导10% IL-6升高需57 mg/m³，这与职业暴露致敏剂量(1.2 mg/m³)存在50倍差距，提示KE2可能不是最敏感终点。
2. Chloramine-T组：即使达到24,730 ng/cm²的高剂量，仅见LDH和IL-8轻微下降，基因谱分析支持其可能通过独特于其他RSs的KE1机制发挥作用。
3. TDI组：100 mg/m³暴露导致TEER值下降、WST-1代谢活性降低等全面毒性反应，印证了该物质通过破坏E-cadherin介导的上皮屏障功能诱发哮喘的经典理论。

讨论部分指出，该研究首次在ALI模型中证实不同RSs可能通过差异化途径激活KE2：piperazine偏向促炎因子释放，TDI主攻屏障破坏，而chloramine-T机制独特。这一发现挑战了现有AOP框架的单一性，提示未来测试策略需考虑化学类别特异性。值得注意的是，piperazine诱导的IL-6升高与人类哮喘患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6水平升高的临床特征高度吻合，为建立基于生物标志物的评估方法提供了依据。

该研究的突破性在于：①首次系统比较三类典型RSs在生理相关暴露模型中的差异响应；②证实IL-6可作为piperazine类RSs的特异性生物标志物；③为完善呼吸道致敏AOP框架提供了实验证据。未来研究需扩大化合物筛查范围，并探索FCS替代方案以完全符合动物实验替代原则。这些发现对制定基于NAMs的测试指南具有重要指导价值，为职业性哮喘的预防和管理提供了新思路。