scRNA-seq 揭秘肠道脑炎微孢子虫在人巨噬细胞中的转录动态：宿主与寄生虫的 “攻防” 新洞察

为探究巨噬细胞对肠道脑炎微孢子虫（Encephalitozoon intestinalis）感染的反应及寄生虫的发育轨迹，研究人员开展了体外感染人巨噬细胞的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）研究。结果显示寄生虫生命周期中有大量转录变化，多数巨噬细胞未对感染产生反应，该研究为理解宿主反应和寄生虫发育提供了新视角。

　　在神秘的微观世界里，微孢子虫（Microsporidia）如同隐藏在暗处的 “杀手”，悄然威胁着人类健康。这类单细胞的细胞内寄生虫，与真菌有着紧密的联系，超过 1500 个物种在自然界中广泛存在，它们能感染包括人类在内的众多宿主。当人类不慎摄入被污染的食物或水，微孢子虫便会在人体内 “安营扎寨”，通常在胃肠道 “落脚”，引发一系列疾病。对于健康人而言，微孢子虫感染可能只是引发自限性腹泻，但对于免疫功能低下的患者，它却可能成为致命的 “恶魔”，引发脑炎、气管支气管炎、肾炎等严重疾病。

肠道脑炎微孢子虫（Encephalitozoon intestinalis）是感染人类的常见微孢子虫之一，主要侵犯小肠，还能扩散到其他器官系统。巨噬细胞作为人体免疫系统的重要 “卫士”，本应肩负起抵御病原体的重任，然而，它却可能成为肠道脑炎微孢子虫的 “避风港”，为寄生虫的复制和传播提供便利。此前，科学家们虽对微孢子虫和宿主感染反应进行了一些研究，但巨噬细胞对感染的反应以及寄生虫的发育轨迹仍存在诸多未知。为了揭开这些谜团，来自纽约大学格罗斯曼医学院（New York University Grossman School of Medicine）、约翰霍普金斯大学（Johns Hopkins University）等机构的研究人员展开了深入探索，相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员运用了多种技术方法来深入探究这一复杂的宿主 - 寄生虫相互作用。其中，单细胞 RNA 测序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术是核心手段。研究人员从人类供体中分离出单核细胞衍生的巨噬细胞（monocyte-derived macrophages），用纯化的肠道脑炎微孢子虫孢子感染它们，并在多个时间点进行观察。同时，研究人员还利用荧光显微镜监测感染情况，通过对细胞进行特定染色，区分成熟孢子和正在复制的寄生虫。此外，为了进一步研究寄生虫和宿主细胞内的基因表达变化，研究人员对感染的巨噬细胞进行了 scRNA-seq 分析，并对测序数据进行了一系列处理和分析，包括数据过滤、归一化、降维、聚类等操作，以挖掘其中蕴含的生物学信息。

下面来详细看看研究结果：

• E. intestinalis 在原代人巨噬细胞中的感染动态：研究人员通过荧光显微镜观察发现，在感染后的 3 小时（hpi）和 12 小时，虽然许多巨噬细胞中含有 1 - 5 个成熟的肠道脑炎微孢子虫孢子，但并未观察到正在复制的寄生虫，这些巨噬细胞可能只是吞噬了接种物中的孢子。到 24 小时，约 5% 的巨噬细胞中出现了正在复制的寄生虫簇，且比之前报道的时间更早。48 - 72 小时，20 - 30% 的巨噬细胞含有新复制的寄生虫，部分寄生虫已发育成孢子母细胞或成熟孢子阶段。这表明寄生虫复制在 24 - 48 小时最为活跃，孢子成熟则发生在 48 - 72 小时。
• scRNA-seq 分析感染 E. intestinalis 的人巨噬细胞：研究人员对感染的巨噬细胞进行 scRNA-seq 分析，共分析了来自 4 个健康人类供体的 39,881 个细胞。通过统一流形近似和投影（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）和无监督聚类，发现细胞可分为 12 个簇（T0 - T11），并分为两个不同的细胞群体：群体 A 主要包含未感染细胞，群体 B 则主要由感染细胞组成。不同供体的细胞在各簇中的分布存在差异，如供体 2 和供体 4 在簇 T3 中的细胞数量较多，而簇 T7 和 T9 仅在供体 3 和供体 4 中出现。进一步分析发现，簇 T4、T5、T6 和 T9 主要包含感染的巨噬细胞，且这些簇中差异表达的基因大多来自肠道脑炎微孢子虫。
• 分析 E. intestinalis 基因表达动态：研究人员单独分析肠道脑炎微孢子虫的转录本，发现基于寄生虫转录本的细胞聚类分析可将寄生虫分为 5 个不同的簇（P0 - P4），这些簇可能代表了寄生虫生命周期的不同发育阶段。时间点分析表明，感染细胞在 3 小时主要集中在簇 P0，12 小时分布在 P0、P1 和 P2，24 小时则分布在所有 5 个簇。随着寄生虫的发育，微孢子虫的转录本水平逐渐增加，这表明寄生虫的负担在不断加重。
• E. intestinalis 发育过程中的差异基因表达分析：在寄生虫发育的早期阶段（P0 - P2），差异表达的基因较少，主要表达一些分子伴侣和管家基因，如 ClpB、Hsp70 和 Hsp90 样蛋白等，这些基因在整个发育过程中持续表达。在簇 P2 中，长链脂肪酸辅酶 A 连接酶（ACSL）的表达略有增加，这可能与寄生虫的膜生物发生有关。簇 P3 标志着寄生虫从基本的细胞代谢和增殖向孢子生产的转变，一些与孢子壁形成、细胞壁多糖合成和重塑相关的基因，以及转运蛋白和水通道蛋白基因等均上调表达。在发育的最后阶段簇 P4，基因表达变化最大，许多已知的极管（polar tube）成分基因上调表达，包括极管蛋白 1（PTP1）等。
• 簇 P3 和 P4 富含参与孢子成熟的分泌蛋白：簇 P4 中许多上调表达的蛋白质含有 Ricin B 型凝集素结构域（RBL），如 PTP4 和 PTP6 等。研究人员在肠道脑炎微孢子虫基因组中鉴定出 14 种推定的 RBL 蛋白，其中 12 种在簇 P4 中上调表达。通过蛋白质分泌实验，发现这些蛋白的 N 端 40 个氨基酸能够介导绿色荧光蛋白（GFP）的分泌，表明它们可能编码真正的信号肽，将蛋白质靶向到分泌途径。此外，簇 P4 中还预测有许多分泌蛋白，其中一些可能参与极管生物发生或孢子成熟过程。研究人员对 Eint_070340 进行免疫荧光显微镜观察，发现它定位于极管，可能在极管组装或功能中发挥作用。
• 分析宿主单细胞转录组：研究人员单独分析宿主转录本，发现细胞聚类可分为 9 个不同的簇（H0 - H8）。感染细胞在不同簇中的分布情况表明，大多数感染的巨噬细胞似乎未能检测到或对入侵的寄生虫作出反应，它们在转录上与未感染细胞无法区分。然而，簇 H5 中感染细胞的比例较高，且转录上与未感染细胞不同，可能对感染作出了反应。簇 H5 中上调表达的基因涉及细胞信号传导、炎症反应等途径，寄生虫在该簇中主要处于感染的后期阶段。簇 H3 在感染样本中也有所扩增，但感染细胞比例不高，其转录特征显示可能是对其他细胞分泌的干扰素作出反应。

研究结论和讨论部分表明，该研究通过 scRNA-seq 技术提供了肠道脑炎微孢子虫发育的转录图谱，确定了寄生虫发育各阶段的分子标记。寄生虫在早期阶段主要表达管家基因和转录起始因子，为复制和增殖做准备；中期阶段，与膜生物发生和细胞代谢相关的基因表达增加；后期则主要表达与孢子形成和极管组装相关的基因。在宿主反应方面，大多数巨噬细胞无法检测到寄生虫感染，而簇 H5 中的细胞可能通过触发细胞焦亡（pyroptosis）来限制寄生虫的复制和传播，簇 H3 中的细胞则可能对干扰素作出反应，但这种反应似乎对体外寄生虫的发育没有影响。该研究揭示了寄生虫发育的分子机制以及宿主细胞反应的异质性，为深入理解微孢子虫感染提供了重要依据，也为未来开发针对微孢子虫感染的治疗策略奠定了基础，有助于科学家们更好地应对微孢子虫感染带来的健康挑战。