PACT 与 ADAR1 协同抵御细胞 “内乱”：精准调控 PKR 激活的关键防线

在细胞抗病毒防御中，蛋白激酶 R（PKR）可被病毒双链 RNA（dsRNA）激活以抑制病毒复制，但需防止其被内源性 dsRNA 异常激活。研究人员开展了 PACT 和 ADAR1 对 PKR 调控作用的研究。结果发现二者协同抑制 PKR 异常激活，缺失会致细胞死亡。该研究对理解免疫调控意义重大。

　　在微观的细胞世界里，一场看不见硝烟的战争时刻都在上演。病毒这个 “不速之客” 一旦入侵细胞，就试图利用细胞的各种资源来疯狂复制自己，给细胞带来巨大危机。好在细胞拥有一套强大的防御系统 —— 先天免疫系统，它就像细胞的 “忠诚卫士”，能识别病毒的特征分子模式并启动防御反应。在这场防御战中，蛋白激酶 R（PKR）是一位重要 “战士”，当它识别到病毒产生的双链 RNA（dsRNA）时，会迅速启动一系列反应，抑制病毒蛋白的合成，从而限制病毒的传播。

然而，事情并没有那么简单。细胞内存在着大量的内源性 RNA，其中一些和病毒的 RNA 结构相似，就像潜伏在细胞里的 “间谍”。如果 PKR 不小心被这些内源性 dsRNA 激活，就会引发一系列不良后果，比如导致细胞翻译关闭，甚至引发细胞死亡，还可能与多种免疫疾病和神经疾病的发生发展有关。所以，如何让 PKR 精准地识别病毒 dsRNA，同时避免被内源性 dsRNA 误导，成为了细胞防御的关键难题。

为了解开这个谜团，来自美国加利福尼亚大学欧文分校等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭示了细胞精准调控 PKR 激活的重要机制。

研究人员采用了多种关键技术方法来探索这一问题。其中，CRISPR-Translate 技术是他们的 “秘密武器”，这是一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选方法，通过监测翻译水平来识别在病毒感染时调节翻译的关键因素。此外，RNA 干扰（RNAi）技术也发挥了重要作用，它能特异性地降低特定基因的表达水平，帮助研究人员研究基因的功能。还有 AlphaFold 3 建模技术，可用于预测蛋白质与 RNA 的相互作用结构，为解释分子机制提供了重要依据。

研究结果主要包括以下几个方面：

1. CRISPR-Translate 筛选出关键调节因子：研究人员利用 CRISPR-Translate 技术，以仙台病毒（SeV）感染 U2OS 细胞进行筛选。结果发现，PRKRA 基因（编码 PACT 蛋白）是促进翻译关闭的关键靶点之一。进一步研究表明，PACT 在多种 RNA 病毒感染时，都能抑制翻译关闭。例如，在 SeV、脊髓灰质炎病毒（PV）和肠道病毒 A-71（EV-A71）感染实验中，PACT 敲除（KO）细胞的翻译抑制水平明显高于野生型（WT）细胞，这表明 PACT 是 RNA 病毒感染时翻译抑制的重要抑制因子。
2. PACT 抑制 PKR 磷酸化及相关过程：研究发现，在 PACT 缺失的情况下，感染 SeV 的 U2OS 和 A549 细胞中 PKR 被强烈激活，其下游靶点真核翻译起始因子 2α（eIF2α）的磷酸化水平也显著增加。同时，应激颗粒的形成也明显增多，应激颗粒是细胞在应激条件下形成的无膜结构，包含未翻译的 mRNA 等成分。而当 PACT KO 细胞补充野生型 PACT 后，PKR 磷酸化水平和应激颗粒形成都得到了抑制，这说明 PACT 能有效抑制 PKR 介导的翻译关闭和应激颗粒形成。
3. PACT 抑制 PKR 的作用机制：通过 AlphaFold 3 建模，研究人员发现 PACT 可与 dsRNA 结合，其结合模式为单体或二聚体。PACT 的 dsRBD1 和 dsRBD2 结构域与 dsRNA 相互作用，dsRBD3 结构域则介导二聚体的形成。当 PACT 结合 dsRNA 后，可能通过直接竞争或形成结构屏障，阻止 PKR 与 dsRNA 结合或二聚化，从而抑制 PKR 的激活。此外，研究还发现 PACT 与 RNA 结合是抑制 PKR 激活的关键，突变 PACT 中与 RNA 结合的关键氨基酸后，其抑制 PKR 的能力显著下降。
4. ADAR1 与 PACT 的协同作用：研究人员通过全基因组 CRISPR-Cas9 sgRNA 缺失筛选发现，ADAR1 基因在 PACT KO 细胞中显著缺失。进一步研究表明，ADAR1 和 PACT 在抑制 PKR 激活方面具有协同作用。当同时敲低 ADAR1 和 PACT 时，细胞会出现合成致死现象，即细胞快速死亡。而单独敲低 ADAR1 或 PACT 时，细胞生长基本不受影响。此外，研究还发现 ADAR1 抑制 PKR 激活的作用不依赖于其脱氨酶活性，主要通过 RNA 结合功能发挥作用。
5. PACT 和 ADAR1 保护细胞免受 PKR 介导的细胞死亡：研究人员构建了 PACT 和 PKR 双敲除（dKO）细胞，发现敲低 ADAR1 后，dKO 细胞不会出现翻译关闭和应激颗粒形成，细胞生长也不受影响。这表明 PACT 或 ADAR1 在防止内源性 RNA 触发 PKR 介导的翻译抑制和细胞死亡方面发挥着重要作用。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了细胞通过 PACT 和 ADAR1 这两个关键因子，构建了两层保护机制来防止 PKR 被内源性 dsRNA 异常激活。在正常情况下，PACT 和 ADAR1 共同维持着细胞内 dsRNA 的可耐受水平，使细胞能够容忍一定量的内源性 dsRNA 存在，而不会激活 PKR。但当病毒感染导致 dsRNA 水平升高，超过了 PACT 和 ADAR1 的保护阈值时，PKR 就会被激活，启动细胞的防御反应。同时，研究还发现 PACT 和 ADAR1 在功能上具有冗余性，它们相互协作，确保细胞在不同情况下都能精准调控 PKR 的激活。这一研究成果对于深入理解细胞的抗病毒免疫机制、以及相关免疫和神经疾病的发病机制具有重要意义，也为未来开发针对这些疾病的治疗策略提供了新的靶点和思路。