一种小调控 RNA（sRNA）通过调节外排泵表达控制金黄色葡萄球菌的抗生素适应性研究

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：A small regulatory RNA controls antibiotic adaptation in Staphylococcus aureus by modulating efflux pump expression

本文聚焦金黄色葡萄球菌（S. aureus），探究小调控 RNA（sRNA）在其适应抗生素过程中的作用。研究发现 RsaA sRNA 通过 MgrA 影响细菌对氟喹诺酮和 β- 内酰胺类抗生素的敏感性，且长形式的 RsaA 基因至关重要，为抗生素治疗提供新靶点与思路。

　　### 研究背景
抗生素耐药性和耐受性问题日益严峻，严重威胁全球健康。金黄色葡萄球菌作为重要致病菌，其对多种抗生素的耐药性给治疗带来极大挑战。小调控 RNA（sRNA）在细菌基因表达调控中发挥关键作用，可影响细菌的多种生理功能，包括对抗生素的适应性，但在革兰氏阳性菌中研究较少。本研究旨在探究 sRNA 在金黄色葡萄球菌适应抗生素过程中的作用机制，为开发新型抗菌策略提供理论依据。

实验方法

1. 细菌菌株、质粒和生长条件：选用金黄色葡萄球菌 HG003 模型菌株进行实验，通过噬菌体介导的转导构建相关突变体。质粒在大肠杆菌 IM08B 中经 Gibson 组装构建，测序验证后转入 HG003 及其衍生物。细菌培养于脑心浸液（BHI）肉汤，根据需要添加抗生素。
2. 适应性竞争试验：构建含有 48 个 sRNA 突变体的文库，在含或不含氟喹诺酮抗生素诺氟沙星的 BHI 培养基中培养 3 天，通过比较不同时间点突变体在文库中的比例，筛选出与诺氟沙星适应性相关的 sRNA。
3. 斑点试验：将过夜培养的细菌进行 10 倍系列稀释，点样于含不同抗生素的琼脂平板上，培养 24 小时后观察细菌生长情况，评估突变体的表型。
4. 液体培养中细菌生长的测量：将细菌接种于 96 孔板，在 CLARIOstar Omega 酶标仪中培养 20 小时，每隔 30 分钟测量 600nm 处的吸光度，监测细菌在液体培养基中的生长情况。
5. Northern 印迹：提取总 RNA，经琼脂糖凝胶电泳分离后，用放射性标记或地高辛（DIG）标记的探针进行杂交，检测 RsaA 不同形式转录本的表达水平。

实验结果

1. RsaA 对金黄色葡萄球菌在诺氟沙星中生长的必要性：适应性竞争试验表明，在诺氟沙星存在下，缺失 RsaA 的突变体（ΔrsaA）在文库中的比例显著下降，斑点试验显示 ΔrsaA 对诺氟沙星的敏感性比野生型（WT）菌株高 100 倍，表明 RsaA 是金黄色葡萄球菌在诺氟沙星中最佳生长所必需的。
2. RsaA 基因长形式对表型的互补作用：RsaA 有长（282bp）、短（144bp）两种转录本形式。用携带 RsaA 长形式基因（pRsaA_L）的质粒转化 ΔrsaA 突变体可恢复其野生型表型，而携带短形式基因（pRsaA_S）的质粒则不能，说明长形式的 RsaA 基因对金黄色葡萄球菌在诺氟沙星中的生长至关重要。
3. RsaA 缺失对金黄色葡萄球菌对环丙沙星敏感性的影响：斑点试验显示，ΔrsaA 突变体对另一种氟喹诺酮类抗生素环丙沙星也更敏感，且这种敏感性可通过 pRsaA_L互补恢复，表明 RsaA 参与保护金黄色葡萄球菌免受氟喹诺酮类抗生素的作用，且该功能依赖长形式基因。
4. RsaA 缺失对金黄色葡萄球菌对 β - 内酰胺类抗生素敏感性的影响：与 WT 菌株相比，ΔrsaA 突变体在 β - 内酰胺类抗生素头孢唑林存在下生长增强，对其他 β - 内酰胺类抗生素如头孢氨苄、氯唑西林和青霉素 G 也有类似现象，且只有 pRsaA_L能恢复 WT 表型，说明 RsaA 缺失降低了金黄色葡萄球菌对 β - 内酰胺类抗生素的敏感性。
5. RsaA 通过 MgrA 发挥作用：RsaA 可抑制主调节蛋白 MgrA 的翻译，MgrA 可调节多种外排泵。对 ΔrsaA 和 ΔmgrA 单突变体及双突变体的斑点试验表明，RsaA 对诺氟沙星敏感性的影响主要通过 MgrA 介导，对头孢唑林敏感性的影响部分通过 MgrA 介导，还可能涉及其他机制。
6. RsaA 长形式基因对短形式表达的重要性：Northern 印迹显示，WT 菌株中短形式 RsaA 转录本水平远高于长形式，但 ΔrsaA 突变体用 pRsaA_S互补时，短形式 RsaA 表达量极低。同时，将表达 RsaA_S和 RsaA_3′L（长形式中短形式没有的部分）的质粒共转化 ΔrsaA 突变体可恢复 WT 表型，表明长形式 RsaA 转录本可能经切割产生短形式，且两种产物相互作用对 RsaA 功能至关重要。
7. RNase Y 与 RsaA 活性的关系：尝试构建 RNase III 突变体未成功，对 RNase Y 突变体（Δrny）的研究发现，其对诺氟沙星的敏感性与 WT 菌株无差异，但对头孢唑林更敏感，与 ΔrsaA 突变体表型相反，说明 RNase Y 不太可能参与 RsaA 的活性调控。

讨论

本研究揭示了 RsaA sRNA 在金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮和 β - 内酰胺类抗生素耐药机制中的重要作用。RsaA 通过主调节蛋白 MgrA 调节外排泵 NorA、NorB、NorC 和 AbcA 的表达，影响细菌对抗生素的敏感性。RsaA 对氟喹诺酮类抗生素的调控完全通过 MgrA，而对 β - 内酰胺类抗生素的调控部分通过 MgrA，可能还涉及其他 mRNA 靶点，如与肽聚糖降解相关的 ssaA_2 和 ssaA2_3 基因。长形式的 RsaA 基因对调节金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性至关重要，其转录本可能经切割产生短形式，且两种产物相互作用发挥功能。虽然未确定切割 RsaA_L的酶，但 RNase Y 不太可能参与该过程。本研究为理解金黄色葡萄球菌的抗生素耐药机制提供了新视角，RsaA 有望成为潜在的治疗靶点，为开发新型抗菌策略提供方向。