5 - 氟胞嘧啶：对抗尿路致病性大肠杆菌的新希望 —— 抑制毒力、清除生物膜且与 β- 内酰胺类协同杀菌

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：The antimycotic 5-fluorocytosine is a virulence inhibitor of uropathogenic Escherichia coli and eradicates biofilm-embedded bacteria synergizing with β-lactams

本文研究发现，FDA 批准的抗真菌药 5 - 氟胞嘧啶（5-FC）对尿路致病性大肠杆菌（UPEC）有抑制作用，能减少生物膜形成、降低毒力因子表达，还可与 β- 内酰胺类抗生素协同清除生物膜内细菌，为治疗 UPEC 感染提供新思路，值得关注。

　　

研究背景

尿路感染（UTIs）在社区和医院中都是广泛存在的公共卫生问题。大肠杆菌（Escherichia coli）是全球范围内引起 UTIs 的主要病原体，其中尿路致病性大肠杆菌（UPEC）最为常见 。UPEC 能感染肠道外组织，其感染的成功依赖于多种毒力因子。像卷曲菌毛（curli fibers）、1 型菌毛（type-1 fimbriae）和 P 菌毛（P-fimbriae）等黏附素，对 UPEC 引发 UTIs 起着重要作用，它们有助于在尿路上皮细胞内形成细胞内细菌群落（IBCs），使细菌逃避免疫系统并在膀胱细胞内繁殖，导致 UTIs 的持续和复发。此外，UPEC 还能分泌可溶性毒素，如外毒素 α- 溶血素（hlyA），可促进红细胞裂解和对宿主尿路上皮的细胞毒性损伤；还有由sat、pic和vat等基因编码的丝氨酸蛋白酶自转运体（Serine Protease Autotransporters of Enterobacteriaceae），具有免疫调节活性，会导致膀胱和肾脏的尿路上皮屏障功能障碍。

抗生素耐药性是 UPEC 感染的另一个关键问题，尤其是与复发性 UTIs 相关。细菌生物膜的形成进一步加剧了抗菌药物耐药性和顽固感染。生物膜是由细菌包裹在自身产生的胞外聚合物（EPS）中形成的密集、多样且有组织的微生物群落。与浮游细菌不同，生物膜中的细菌对大多数治疗用抗生素具有显著的抗性，这给治疗带来了巨大挑战。例如，生物膜内细菌转变为缓慢生长或休眠状态，降低了对靶向细胞分裂的抗生素的敏感性；而且生物膜 EPS 可能阻碍抗菌药物的渗透，并调节细菌细胞被免疫系统识别的过程。

已有研究表明，FDA 批准的抗真菌药物 5 - 氟胞嘧啶（5-FC）和其他氟嘧啶类药物对多种细菌具有抗生物膜活性。本研究旨在探究 5-FC 对临床相关 UPEC 分离株的作用，发现它不仅能抑制生物膜形成，还能抑制毒力因子表达，并且与 β- 内酰胺类抗生素联合使用时，可有效根除预先形成的成熟生物膜内的细菌。

研究结果

1. 5 - 氟胞嘧啶通过嘧啶饥饿和抑制卷曲菌毛防止 UPEC 生物膜形成：在参考菌株 MG1655 中，5-FC 通过抑制编码卷曲菌毛的基因转录来抑制生物膜形成。本研究测试了 5-FC 对 10 株临床分离株（9 株 UPEC 和 1 株粪便分离株）生物膜形成和黏附的影响。实验在 30°C（实验室条件下卷曲菌毛表达最高的温度）和 37°C（宿主标准体温）下进行。结果显示，在 2.5 μg/mL（对大肠杆菌为亚抑制浓度）的 5-FC 处理下，四分之三的受试 UPEC 临床分离株在 30°C 和 37°C 时生物膜黏附均降低 1 - 2.3 倍。

考虑到尿液 pH 值的显著变化以及有报道称 5-FC 的抗菌活性在其他微生物中受 pH 影响，研究人员评估了 5-FC 在不同 pH 条件下的抗菌和抗生物膜特性。结果发现，在测试的最高 5-FC 浓度（256 μg/mL）下，对细菌生长没有抑制作用，与实验室菌株 MG1655 不同（在 MG1655 中，32 μg/mL 的 5-FC 会导致 50% 的生长减少）。并且在所有测试的 pH 水平下，2.5 μg/mL 的 5-FC 在 30°C 和 37°C 时均能持续抑制生物膜形成，pH 的变化对其抑制效果没有系统性影响。因此，后续实验使用 pH 6.4 ± 0.2 的标准 YESCA 培养基，该 pH 值在男性和女性尿液 pH 的中位数范围内。

对强生物膜产生菌株 KTE223 的研究发现，5-FC 处理在 30°C 和 37°C 时分别抑制csgB和csgD基因表达 5.3 倍和 5.7 倍。同时，5-FC 暴露刺激了de novo嘧啶途径基因pyrB（30°C 时表达增加 3.2 倍，37°C 时增加 8.3 倍）和核苷酸响应调节因子 Fis（30°C 时表达增加 2.8 倍，37°C 时增加 15 倍）的表达，这表明 5-FC 处理导致 UPEC 中的嘧啶饥饿，与在E. coli MG1655 中的观察结果相似。2. 5 - 氟胞嘧啶抑制毒力决定因子的表达，阻碍 UPEC 的致病性：除了抑制卷曲菌毛的产生，de novo嘧啶生物合成的扰动还会影响黏附侵袭性大肠杆菌中 1 型菌毛的表达。因此，研究人员推测 5-FC 可能也会对 UPEC 中其他毒力因子的产生产生负面影响。对 KTE223 菌株基因组中编码的 1 型菌毛基因fimA、P 菌毛（papC）、α- 溶血素（hlyA）和分泌的自转运毒素（pic、vat、sat和sinH）等毒力因子的表达进行测试。

结果显示，5-FC 在宿主温度下能够使黏附素编码基因fimA和papC的表达分别降低 30 倍和 22 倍。同时，分泌毒素编码基因也受到抑制，如hlyA、pic和sinH在 37°C 时表达分别降低 22 倍、3.6 倍和 2.6 倍，vat和sat基因在 30°C 时表达分别降低 3.2 倍和 3.8 倍。与hlyA表达的抑制一致，用 2.5 μg/mL 的 5-FC 处理 KTE223 菌株后，其溶血活性降低了 33%。在作为阴性对照的低溶血hlyA阴性菌株 KTE221 和 MG1655 中，也观察到了非常轻微但不显著的影响。

由于 5-FC 具有很强的抗毒力活性，研究人员测试了其对 KTE223 细菌黏附膀胱上皮细胞的影响。结果表明，5-FC 以剂量依赖的方式降低 KTE223 的黏附，最高可达 4.3 倍，这与黏附因子产生的抑制一致。在感染实验中，尽管 5-FC 减少了 KTE223 的黏附，但上皮细胞的存活率仅略有增加，可能是由于 KTE223 仍有残留的可溶性外毒素产生。不过，在 10 μg/mL 5-FC（对膀胱上皮细胞和细菌均远低于毒性浓度）存在下，上皮细胞存活率从 55% 提高到了 74%。总体而言，5-FC 的活性不仅限于抑制卷曲菌毛基因表达，还能影响 KTE223 多种毒力决定因子的产生，虽然不能完全消除 KTE223 的细胞毒性，但在定植和急性感染期间可能具有调节其细胞毒性的潜力。3. 5-FC 增强 β- 内酰胺类抗生素对 KTE223 生物膜的抗菌活性：虽然 5-FC 可以防止大肠杆菌生物膜的形成和黏附，但临床环境中的主要挑战是治疗预先形成的成熟生物膜，这些生物膜通常对抗生素具有抗性。因此，研究人员使用强生物膜产生的 UPEC 菌株 KTE223，评估 5-FC 根除预先形成的生物膜并影响生物膜内细菌活力的能力，以及它与用于治疗 UTIs 的不同抗生素联合使用时的潜在效果。

研究人员测量了 5-FC 单独使用（2.5 μg/mL，能够降低黏附的亚抑制浓度）以及与环丙沙星、庆大霉素、头孢他啶（CAZ）、哌拉西林（PIP）和氨曲南（ATM）等不同浓度抗生素联合使用时的最低生物膜根除浓度（MBEC）。用结晶紫法测量发现，5-FC 处理及其与抗生素的联合使用在所有测试浓度下都没有破坏 KTE223 形成的成熟生物膜，与未处理的对照相比，黏附细胞数量相同。然而，当使用荧光素二乙酸酯（FDA）评估生物膜内细菌活力时，发现单独使用任何一种抗生素都不会导致细菌活力降低，但 5-FC 与 β- 内酰胺类抗生素（CAZ、ATM、PIP）联合使用会导致 FDA 荧光显著降低。例如，2.5 μg/mL 的 5-FC 与 2 μg/mL 的 CAZ 联合使用时，荧光降低了 50%。这种效果在 30°C 和 37°C 时相似，在宿主温度下影响略高。通过对处理后预先形成的生物膜内活细胞计数也表明，2.5 μg/mL 的 5-FC 与 2 μg/mL 的 CAZ 联合使用时，CFU/mL 降低了 50%。而 5-FC 单独使用或与氟喹诺酮类或氨基糖苷类联合使用时，均未观察到活力降低，这表明 5-FC 与 β- 内酰胺类抗生素存在特定的协同机制。这种协同效应在其他生物膜形成分离株，如 KTE191 和 KTE221 中也得到了证实。值得注意的是，用于处理成熟生物膜的上清液中的细菌滴度在 5-FC 或 5-FC 与不同浓度 CAZ 存在下，CFU/mL 没有差异，这表明生物膜内的细菌在药物处理后不会释放到废培养基中，活力的降低确实是由于生物膜结构内细菌细胞的死亡。

讨论

细菌生物膜对健康构成重大挑战，主要原因是它们对抗生素具有抗性，导致当前治疗大多无效，进而引发复发性感染，如复发性 UTIs。尽管对新型抗生物膜药物的研究广泛，但尚无新的主要抗菌或抗毒力药物进入临床治疗。

本研究证实，5-FC 对实验室大肠杆菌菌株 MG1655 的抗生物膜特性也适用于临床相关的大肠杆菌菌株，主要是从 UTI 患者中分离得到的菌株。5-FC 减少生物膜形成的作用不仅在 30°C（实验室条件下卷曲菌毛产生和生物膜形成的最佳温度）下存在，在 37°C 以及广泛的 pH 范围（5 - 8，涵盖尿液 pH 的生理和病理变化）内也存在。而且 pH 变化不影响 5-FC 在临床分离株中的最低抑菌浓度（MIC），与在烟曲霉中的发现形成对比，这突出了两种生物在生理学上的差异。临床分离株对 5-FC 的 MIC 在高达 256 μg/mL 时仍未检测到，远高于抑制实验室菌株 MG1655 所需的浓度。这表明临床分离株对 5-FC 作为抗菌药物具有更大的生理抗性，而本研究中使用的浓度（2.5、5.0、10 μg/mL）远低于抑制阈值，既能有效降低测试菌株的致病潜力，又能最小化耐药性的选择压力。

5-FC 的生物活性不仅限于抑制生物膜，还能不同程度地降低 UPEC 中多种保守毒力因子的表达，包括参与宿主细胞定植的黏附素（卷曲菌毛、1 型菌毛和 P 菌毛）以及对宿主组织造成损伤的 α- 溶血素和分泌毒素（Pic、Vac、Sat、SinH）。虽然 5-FC 不能完全消除 KTE223 的致病性，但低水平的 5-FC 足以减少膀胱上皮的细菌定植，并在 KTE223 感染时使宿主细胞存活率略有增加。由于分泌毒素未被完全消除，尽管细胞黏附显著降低，但上皮细胞活力的增加相对有限。这表明 5-FC 作为抗毒力药物单独用于临床实践可能并不完全有效，但作为抗生素治疗的辅助药物可能更有价值。

生物膜会降低抗生素的疗效，能够直接靶向生物膜内细菌的分子很少。在这种情况下，5-FC 展现出独特且有吸引力的特性，它能够增强针对肽聚糖生物合成的抗生素（β- 内酰胺类 / 头孢菌素类）对体外培养的生物膜内 UPEC 的抗菌活性，且这种协同作用具有特异性，与针对 DNA 复制的环丙沙星和针对蛋白质合成的庆大霉素没有协同作用。虽然其作用机制目前尚不清楚，但 5-FC 在大肠杆菌实验室菌株 MG1655 中通过影响细胞内嘧啶可用性发挥抗生物膜活性，部分是通过一种主要的肽聚糖合酶。5-FC 处理后 UPEC 中响应嘧啶核苷酸可用性的基因表达增加，以及 5-FC 与靶向肽聚糖生物合成的药物协同作用，进一步表明在大肠杆菌致病型中，嘧啶核苷酸生物合成与毒力机制之间存在保守联系，这不仅适用于 UPEC，也适用于其他致病菌株。

由于 5-FC 已在临床实践中使用，对其生物利用度和安全性的担忧较低，这与细胞毒性试验结果一致。因此，重新利用 5-FC 可能是满足临床治疗生物膜感染需求的创新方法，可以将其与 β- 内酰胺类抗生素联合用于根除生物膜细菌，或者在某些情况下单独使用以最小化组织损伤并通过抑制毒力因子预防再感染。尽管本研究存在局限性，如测试的临床分离株数量较少且缺乏体内感染模型，但已有充分证据表明，抑制嘧啶生物合成，无论是通过基因还是化学手段，都会影响不同大肠杆菌致病型的生物膜形成和毒力。特别是 5-FC 与 β- 内酰胺类抗生素之间的协同作用，可能与 5-FC 对细胞壁合成的干扰有关，这为生物膜感染的治疗提供了有前景的方法，也表明新型的de novo嘧啶生物合成抑制剂可能具有类似甚至更好的潜力。

材料和方法

1. 细菌菌株和生长条件：本研究使用了 9 株 UPEC 临床分离株和 1 株来自健康对照粪便菌群的大肠杆菌分离株，这些分离株来自丹麦 Rigshospitalet 临床微生物学系，取自 UTI 患者，包括约 78% 的女性和 22% 的男性，感染分为 11% 医院获得性和 88% 社区获得性。这些分离株代表了不同的 UPEC 基因型，分布在系统发育组 A（11%）、B2（77%）和 D（11%）中。抗生素敏感性测试显示，除 KTE223 对氨苄青霉素和磺胺甲恶唑耐药外，所有分离株对多种抗生素敏感。并且这些分离株均基于卷曲菌毛编码操纵子（csgBAC和csgGDEF）的阳性筛选而纳入研究。

细菌常规在 YESCA 培养基（10 g/L 酪蛋白氨基酸、1.5 g/L 酵母提取物、0.05 g/L 硫酸镁、0.005 g/L 氯化锰）中于 30°C 或 37°C 振荡培养（150 rpm），或在 LB 琼脂培养基（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、5 g/L 氯化钠、15 g/L 琼脂）上培养。YESCA 培养基的 pH 值为 6.4 ± 0.2。为测试 5 - 氟胞嘧啶（5-FC，在无菌超纯水中的储备浓度为 10 mg/mL）的作用，按指定浓度添加。通过使用 NaOH 或 HCl 调节培养基至所需 pH 值，评估 pH 对 5-FC 活性的影响。2. 基因表达分析：采用定量实时 PCR（RT-qPCR）测量基因表达水平，方法与之前描述的相同。在含有或不含 5-FC 的 YESCA 培养基中于 30°C 或 37°C 振荡培养 24 小时后，提取 RNA。用于扩增的引物完整列表在相关表格中报告。3. 生物膜形成：对于静态生物膜黏附试验，将在 YESCA 培养基中过夜培养的大肠杆菌培养物调整至 OD₆₀₀ = 0.025，在 96 孔平底板的 YESCA 培养基中于 30°C 或 37°C 静态培养 24 小时。使用结晶紫（CV）染色法测定黏附，方法与之前报道的相同。4. 最低生物膜根除浓度（MBEC）和成熟生物膜中细菌活力的测定：根据临床和实验室标准协会指南并稍作修改，使用标准微量稀释法评估 5-FC 及其与抗生素联合对预先形成的大肠杆菌生物膜的 MBEC。简要来说，将过夜培养物在 96 孔微量滴定板中用 200 μL YESCA 调整至 OD₆₀₀ ≈ 0.025，然后在 30°C 或 37°C 静态培养以形成生物膜。生长 20 小时后，去除浮游细胞并转移到新板中进行 OD₆₀₀读数。用含有所需稀释度的 5-FC、抗生素或它们的组合的 200 μL YESCA 处理预先形成的生物膜，在 30°C 或 37°C 孵育 6 小时。去除废培养基，使用 CV 染色法进行生物膜定量。

同时，按照参考文献中的方法，通过测量 FDA 水解为黄色荧光分子 “荧光素” 来测定预先形成的生物膜内细菌的活力和代谢活性。具体操作是将 10 mg/mL 的 FDA 丙酮溶液稀释至最终浓度为 0.1 mg/mL 的 100 mM 3-(N - 吗啉代)- 丙烷磺酸（MOPS，pH 7.0）溶液，在去除废培养基后，将 200 μL 该溶液加入到含有药物处理或未处理的预先形成的生物膜的孔中。在 37°C 静态孵育 1 小时后，在 494 nm 处读取吸光度，荧光以 “未处理的百分比” 表示，即相对于未处理条件（100%）的函数。<