精准检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）变异体：表型与基因型方法的评估及临床意义

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Evaluation of phenotypic and genotypic methods for detecting KPC variants

这篇研究聚焦肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）变异体检测。KPC 变异体多样，影响检测准确性。研究构建 45 种变异体，评估多种检测方法性能。结果显示不同方法对各表型检测灵敏度有差异，推荐联合检测，为临床防控提供重要依据。

　　### 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）变异体研究背景
肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）是肠杆菌科细菌中常见的碳青霉烯耐药机制，在多个国家广泛流行，其中 KPC - 2 和 KPC - 3 最为常见。KPC 能使细菌对多种 β - 内酰胺类抗生素及标准 β - 内酰胺酶抑制剂产生耐药性，不过新型 β - 内酰胺酶抑制剂（如阿维巴坦、沃拉巴坦和瑞来巴坦）对 KPC 有抑制作用，可降低体内死亡率。

在抗生素选择压力下，KPCβ - 内酰胺酶快速多样化，截至 2025 年 1 月，已发现 242 种临床变异体，部分对头孢他啶 - 阿维巴坦耐药。KPC 基因的插入、缺失和点突变多发生在活性位点周围的三个环（ω - 环_{164 - 179}、环_{238 - 243}和环_{267 - 275}），这些突变改变了蛋白质水解 β - 内酰胺抗生素的能力，产生多种耐药表型，给变异体的检测带来挑战。而体内变异体可能回复到初始的碳青霉烯耐药表型，因此准确检测 KPC 变异体对指导治疗和防控措施至关重要。

研究方法

1. 菌株与诱变：研究选用 45 种 KPC 变异体，涵盖 KPC - 2 或 KPC - 3 两种遗传背景，包括祖先酶及部分非临床变异体。其中 7 种变异体为先前研究构建，38 种为新构建。通过重叠引物诱变，以 pBR322 - KPC - 2 或 pBR322 - KPC - 3 为模板，经扩增、酶切、纯化和连接等步骤获得变异体，将其转入大肠杆菌 TOP10 表达，并采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。
2. 基于药敏谱的主成分分析（PCA）：采用纸片扩散法在 Mueller - Hinton 琼脂上进行抗生素敏感性测试，测定代表 β - 内酰胺类抗生素的抑菌圈直径，利用 R 软件和 FactoMineR 包进行 PCA 分析，以探索数据结构和模式。
3. 快速诊断测试：评估两种侧向流动免疫分析（LFIA），即 Resist - 5 O.K.N.V.I. 检测和 NG - Test Carba 5，用于检测 KPC 蛋白特定表位；两种水解试验，即 Beta Carba 测试和 Rapidec Carba NP，用于检测碳青霉烯酶活性；以及 Beta Lacta 测试，用于检测超广谱 β - 内酰胺酶（ESBL）活性。
4. 选择性琼脂培养基检测敏感性：测试三种选择性培养基 ChromID Carba Smart、ChromID ESBL 和 Chromatic Super CAZ/AVI 对 KPC 变异体的检测能力，将菌株调整至不同浓度接种，在 35 ± 2°C 培养 24 小时。
5. 分子测试：评估两种基于 PCR 的快速检测方法，即 Xpert Carba - R 检测和 BioFire FilmArray Blood culture BCID2，制备浓度为 10⁵ CFU/mL 的菌悬液进行检测。

研究结果

1. 菌株、药敏测试及 KPC 变异体分类：所选变异体包含临床常见突变位点，如 D179、A172 等。这些突变对蛋白质水解能力影响不同，45 种变异体对多种抗生素呈现不同耐药性，部分仍保留水解碳青霉烯类抗生素的能力。通过 PCA 分析，确定了 “祖先 KPC”“KPC - 样”“ESBL - 样”“头孢他啶酶” 和 “混合” 5 种表型聚类。“祖先 KPC” 对多数 β - 内酰胺类抗生素耐药，但对头孢他啶 - 阿维巴坦敏感；“KPC - 样” 表型类似祖先酶，部分对头孢他啶 - 阿维巴坦耐药，对碳青霉烯类抗生素敏感性较高；“ESBL - 样” 表型对阿莫西林和头孢噻肟耐药，与 β - 内酰胺酶抑制剂有强协同作用，部分对头孢他啶 - 阿维巴坦耐药，对碳青霉烯类抗生素敏感；“头孢他啶酶” 表型对头孢他啶有高度特异性耐药，对其他 β - 内酰胺类抗生素敏感，多数对头孢他啶 - 阿维巴坦耐药；“混合” 表型菌株呈现多种不同的耐药特征。
2. 快速诊断测试结果
   • LFIA：Resist - 5 O.K.N.V.I 和 NG - Test Carba 5 分别正确检测出 40 种（88%）和 39 种（87%）KPC 变异体。部分 “头孢他啶酶” 表型且在 ω - 环有突变的菌株未被两种测试检测到，还有个别 “KPC - 样” 表型菌株仅被一种测试检测到。
   • 水解试验：Beta Carba 测试和 Rapidec Carba NP 测试分别检测出 25 种（56%）和 21 种（47%）KPC 变异体，主要为 “KPC - 样” 或 “混合” 表型。Beta Lacta 测试检测出 36 种（80%）菌株，未检测出的均为 “头孢他啶酶” 表型。
   
   
3. 选择性显色琼脂培养基检测敏感性：29 种（64%）KPC 变异体可在 ChromID Carba Smart 和 ChromID ESBL 培养基上生长，不同表型在不同培养基上生长情况有差异。Chromatic Super CAZ/AVI 培养基能检测出多数头孢他啶 - 阿维巴坦耐药菌株，包括多种表型的变异体。
4. PCR - 基于测试结果：两种分子检测方法对所有变异体的检测敏感性均为 100%。

讨论

KPCβ - 内酰胺酶的快速多样化导致多种水解和耐药表型，突变引发的耐药性与补偿性敏感性之间的权衡影响临床治疗，因此准确快速的检测至关重要。LFIA 检测灵敏度较高，但部分突变可能影响检测结果。水解试验与耐药谱相关性较好，但对 “ESBL - 样” 和 “头孢他啶酶” 表型变异体检测能力有限。选择性培养基对不同表型的检测效果不同，如 ChromID Carba Smart 培养基可检测 “KPC - 样” 等变异体，但无法检测 “ESBL - 样” 和 “头孢他啶酶” 表型变异体；ChromID ESBL 培养基可检测 “ESBL - 样” 变异体；Chromatic Super CAZ/AVI 培养基对检测 “头孢他啶酶” 表型变异体有优势。

研究表明单一检测方法存在局限性，联合检测可能更有效。对于粪便携带筛查，建议使用多种选择性培养基。临床中，抗生素敏感性测试中对头孢他啶或头孢他啶 - 阿维巴坦的耐药性及特定表型可提示 KPC 变异体的存在，LFIA 可作为一线检测方法，根据不同表型选择合适的检测方法，高度怀疑时可进行 PCR 检测。

本研究存在一定局限性，45 种变异体不能完全代表所有临床变异体，临床分离株可能存在其他耐药机制，影响检测。但研究结果仍为微生物学家检测 KPC 变异体提供了重要参考，强调了面对可能表达 KPC 变异体的肠杆菌科细菌时需保持警惕。