EGF 上调的 lncRNA ESSENCE：结直肠癌治疗新靶点的关键发现

为解决结直肠癌（CRC）治疗难题，研究人员开展了关于 EGFR/MAPK 信号通路相关 lncRNA 在 CRC 中作用的研究。结果发现 ESSENCE 可促进 CRC 生长，联合使用 MEK 抑制剂和铁死亡诱导剂能抑制 ESSENCE 高表达的 CRC。该研究为 CRC 治疗提供新策略。

　　在癌症的研究领域中，结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）一直是令人头疼的难题。它的发病率和死亡率居高不下，现有的治疗手段，像手术切除搭配辅助化疗，效果却不尽如人意。不少患者会面临肿瘤复发的困境，而且对当下的免疫 checkpoint 疗法也不敏感。这就迫切需要寻找新的癌症生物标志物，开发更有效的治疗策略。与此同时，表皮生长因子受体 / 丝裂原活化蛋白激酶（EGFR/MAPK）信号通路在多种癌症的发展中起着关键作用，不过它在 CRC 中的下游靶基因以及作用机制还没有完全弄清楚。在非编码 RNA 的研究热潮中，长链非编码 RNA（lncRNA）的功能逐渐受到关注，但 EGFR/MAPK 信号通路调控的 lncRNA 在 CRC 中的作用，依旧是个未解之谜。

为了攻克这些难题，中山大学附属第六医院的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Research》上，为 CRC 的治疗带来了新的希望。

研究人员运用了多种技术方法。在细胞实验方面，他们培养了多种细胞系，像 HEK293T、HT - 29 等，并进行细胞转染操作，以此来调控基因的表达。通过构建 Dox 诱导的 ESSENCE 敲低细胞，研究其对细胞功能的影响。在动物实验上，建立了异种移植小鼠模型和患者来源的异种移植（PDX）模型，观察肿瘤的生长情况。同时，运用定量实时 PCR（qRT - PCR）技术检测基因表达水平，采用免疫印迹、免疫沉淀等方法研究蛋白质的相互作用和表达变化，还利用 RNA 测序和生物信息分析挖掘关键基因和信号通路。此外，研究中使用的样本队列来自中山大学附属第六医院接受根治性切除术的患者，收集了 CRC 肿瘤样本和匹配的非肿瘤相邻结直肠组织。

下面来看具体的研究结果：

1. EGFR/MAPK 上调的 lncRNA ESSENCE 与 CRC 预后不良正相关：研究人员对 HCT116 细胞进行 EGF 或司美替尼（selumetinib）处理后，分析 lncRNA 的表达变化，筛选出了 16 个候选 lncRNA，其中 ESSENCE（ENST00000415336）变化显著。在多个 CRC 细胞系和患者样本中都证实，EGF 处理会使 ESSENCE 表达上调，司美替尼处理则使其下调。通过对数据库的分析以及患者样本检测发现，CRC 组织中 ESSENCE 表达高于正常组织，且高表达 ESSENCE 的患者总体生存率更低。进一步实验表明，敲低 ESSENCE 可抑制 CRC 细胞增殖和集落形成，过表达则促进细胞增殖和集落形成，这说明 ESSENCE 在 CRC 细胞生长中起致癌作用。
2. EGF 上调的 lncRNA ESSENCE 表达由 EGF 下游转录因子 EGR1 介导：通过对 ESSENCE 启动子区域的生物信息分析，预测出 EGR1、SP3 和 SP1 可能是其转录因子。实验发现，过表达 EGR1 可上调 ESSENCE 表达，而敲低 EGR1 则抑制其表达。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实 EGR1 能结合到 ESSENCE 启动子的多个位点，且 EGF 处理会增强这种结合。构建荧光素酶报告基因实验也表明，EGR1 能调控 ESSENCE 的转录活性，说明 EGF 诱导的 ESSENCE 上调是由 EGR1 与 ESSENCE 启动子结合介导的。
3. ESSENCE 与 CAD 相互作用并调节 CAD 的稳态表达：为探究 ESSENCE 的作用机制，研究人员进行 RNA - 蛋白质 pull - down 实验，发现 CAD 是与 ESSENCE 相互作用的潜在蛋白之一。在 CRC 组织中，CAD 蛋白水平较高，且与患者生存率相关。RNA pull - down 和免疫印迹实验证实 ESSENCE 与 CAD 相互作用，敲低 ESSENCE 会降低 CAD 的稳态表达，过表达则使其升高。功能研究显示，过表达 CAD 可缓解 ESSENCE 敲低对细胞活力和集落形成的抑制作用。在体内实验中，构建的 CRC 异种移植小鼠模型表明，敲低 ESSENCE 可抑制肿瘤生长，降低肿瘤组织中增殖标记物和 CAD 的表达，说明 CAD 是 ESSENCE 介导 CRC 肿瘤发生的功能靶点。
4. ESSENCE 抑制 E3 泛素连接酶 KEAP1 介导的 CAD 降解：研究发现，ESSENCE 对 CAD 的调节发生在转录后水平。敲低 ESSENCE 会加速 CAD 的周转，过表达则延长其半衰期，且 ESSENCE 调节 CAD 涉及减少多聚泛素化过程。通过筛选 E3 泛素连接酶，发现 KEAP1 可促进 CAD 的泛素化和降解。KEAP1 能识别 CAD 上的特定序列（1281TSTGE1287）并与之结合，突变该序列可减弱 KEAP1 与 CAD 的相互作用，降低 CAD 的泛素化水平，表明 KEAP1 通过该序列介导 CAD 的泛素化和降解。
5. ESSENCE 减弱 KEAP1 与 CAD 的相互作用：进一步研究发现，ESSENCE 不影响 KEAP1 的稳态表达。通过对 CAD 结构域的研究，发现 KEAP1 和 ESSENCE 都结合到 CAD 的 C2 结构域。实验表明，ESSENCE 可与 KEAP1 竞争结合 CAD，敲低 ESSENCE 会增加 KEAP1 与 CAD 的结合，过表达则减少这种结合，且过表达 ESSENCE 可减轻 KEAP1 诱导的 CAD 多聚泛素化，说明 ESSENCE 通过竞争性结合 CAD，干扰 KEAP1 与 CAD 的相互作用，抑制 CAD 的降解。
6. ESSENCE 通过 CAD - DHODH 轴介导铁死亡防御：对敲低 ESSENCE 的 HCT116 细胞进行转录组分析，发现与细胞增殖、代谢相关的通路在 ESSENCE 高表达组富集，而与铁死亡相关的过氧化物酶体通路在 ESSENCE 敲低组富集。由于 CAD 的下游酶二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）与铁死亡防御有关，研究人员检测发现，敲低 ESSENCE 或 CAD 会诱导细胞脂质过氧化和铁死亡，而过表达 CAD 可逆转 ESSENCE 敲低导致的脂质过氧化增加，敲低 DHODH 则可恢复 CAD 过表达对脂质过氧化的抑制作用。在体内实验中，ESSENCE 敲低的肿瘤组织中，铁死亡相关蛋白 GPX4 和 SLC7A11 的表达降低，说明 ESSENCE 通过 CAD - DHODH 轴以及调节 GPX4 和 SLC7A11 的表达来介导铁死亡防御。
7. MEK 抑制剂司美替尼和铁死亡诱导剂柳氮磺胺吡啶联合治疗抑制 ESSENCE 高表达的人 CRC PDX 模型中的肿瘤生长：在细胞实验中，联合使用司美替尼和柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine）对 CRC 细胞集落形成的抑制效果优于单一药物。在 PDX 模型实验中，对于 ESSENCE 高表达的 PDX 肿瘤，联合治疗显著抑制肿瘤生长，降低 Ki - 67、PCNA 和 CAD 的表达；而对于 ESSENCE 低表达的 PDX 肿瘤，联合治疗效果不明显。这表明 ESSENCE 可作为一个有价值的生物标志物，联合使用司美替尼和柳氮磺胺吡啶对治疗 ESSENCE 高表达的 CRC 患者具有潜在应用前景。

综合研究结论和讨论部分，该研究揭示了 EGFR - MAPK - EGR1 信号通路、ESSENCE、CAD 以及铁死亡之间的复杂调控关系。EGF 激活 EGR1，进而上调 ESSENCE 的表达，ESSENCE 通过与 KEAP1 竞争结合 CAD，稳定 CAD 蛋白水平，促进嘧啶合成和铁死亡防御，最终推动 CRC 的发展。同时，研究发现联合靶向 ERK - EGR1 信号通路和铁死亡防御，对抑制 ESSENCE 高表达的 CRC 生长有显著效果。这一研究为 CRC 的诊断和治疗提供了新的生物标志物和治疗策略，有助于推动 CRC 精准医学的发展，具有重要的临床意义。