Retromer 促进线粒体 DNA（mtDNA）的溶酶体周转：解锁线粒体质量控制新机制

《SCIENCE ADVANCES》：Retromer promotes the lysosomal turnover of mtDNA

为探究 mtDNA 复制应激下线粒体基因组的清除机制，研究人员开展了以 Retromer 在 mtDNA 周转中作用为主题的研究。结果发现 Retromer 促进线粒体衍生小泡形成并协助 mtDNA 转运至回收细胞器，在果蝇模型中也证实其可改善 mtDNA 相关缺陷，对维持线粒体功能意义重大。

　　在细胞的微观世界里，线粒体就像一座繁忙的能量工厂，为细胞的各种活动提供动力。而线粒体中含有的线粒体 DNA（mtDNA），虽个头不大，却编码着 13 种对线粒体呼吸链至关重要的蛋白质，以及部分参与线粒体蛋白质合成的 RNA 和 tRNA，对维持线粒体功能和细胞内环境稳定起着不可或缺的作用。

然而，这座 “能量工厂” 在运转过程中却面临着诸多挑战。在产生三磷酸腺苷（ATP）的过程中，会产生活性氧（ROS），包括超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等。这些 ROS 就像一群不安分的 “小怪兽”，不仅会破坏蛋白质和脂质，还会对 mtDNA 发起攻击，改变其生化特性，影响线粒体基因组的稳定性，进而引发一系列问题。mtDNA 损伤的逐渐积累与许多人类疾病的发生发展密切相关，还会加速衰老，严重时甚至导致细胞死亡。

目前，虽然已经发现了多种线粒体的选择性降解途径，如 PINK1 - Parkin 自噬途径等，但对于 mtDNA 在应激情况下的具体降解机制，尤其是在 mtDNA 复制应激时，其如何从线粒体中转运出来并被降解，仍存在许多未解之谜。为了揭开这些谜团，深入了解 mtDNA 的质量控制机制，研究人员开展了一系列研究。相关研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是利用接近生物素标记技术（proximity biotinylation），结合 Split - TurboID 系统，检测线粒体 - 内体接触位点的邻近蛋白质组；二是通过构建 CRISPR - Cas9 敲除（KO）细胞系，研究 Retromer 各亚基对线粒体形态和功能的影响；三是借助果蝇（Drosophila）模型，在体内验证 Retromer 对 mtDNA 质量控制的作用；四是运用共聚焦显微镜（confocal microscopy）、电子显微镜（electron microscopy）等成像技术，直观观察线粒体和 mtDNA 的变化。

下面来看具体的研究结果：

• mtDNA 损伤改变线粒体 - 内体接触位点的蛋白质组：研究人员通过表达线粒体解旋酶 Twinkle 的显性负突变体 TWNK^K319E，特异性地干扰 mtDNA 复制。结果发现，这一操作导致 mtDNA 拷贝数减少，并且使线粒体 - 内体的蛋白质组发生了显著变化。在 mtDNA 复制应激状态下，线粒体附近出现了更多与溶酶体相关的蛋白质，表明 mtDNA 应激促使线粒体招募溶酶体相关蛋白，以促进线粒体成分的降解。
• Retromer 促进 mtDNA 复制应激时的线粒体碎片化：Retromer 是由 VPS35、VPS29 和 VPS26 组成的三聚体蛋白复合物，在细胞内囊泡运输和溶酶体成熟等过程中发挥着重要作用。研究发现，在 mtDNA 复制应激时，Retromer 的核心成分 VPS35 与线粒体的共定位增加，并且 VPS35 能够使线粒体发生碎片化。通过构建 Retromer 各亚基的 KO 细胞系进一步证实，Retromer 对于线粒体应对 mtDNA 复制应激至关重要，其中 VPS35 独立于其他亚基，具有使线粒体碎片化的能力。
• Retromer 促进线粒体应激时线粒体基质成分的释放：有研究提出，Retromer 可能通过形成线粒体衍生小泡（MDVs）参与线粒体质量控制。研究人员在实验中观察到，mtDNA 复制应激会诱导形成 TOM20^?/PDH⁺的小泡，这些小泡的形成依赖于 Retromer 和线粒体裂变蛋白 DRP1 以及转运蛋白 Miro1，且与从线粒体内膜衍生的小泡（VDIMs）不同。这表明 mtDNA 复制应激会激活与 MDV 途径类似的、依赖溶酶体的线粒体基质质量控制机制。
• mtDNA 在 mtDNA 应激时直接转运至内体系统的小泡：研究人员发现，mtDNA 的释放与线粒体基质 MDVs 的形成是相互独立的过程。mtDNA 的释放依赖于 Retromer 和 Bcl - 2 相关 X 蛋白 BAX，并且可能直接释放到细胞质中，随后被转运至回收细胞器。通过相关光镜和电镜（CLEM）技术以及电子断层扫描技术观察发现，mtDNA 会转移到与 VPS35 共定位的回收细胞器中，进一步证实了这一转运过程。
• 活跃的溶酶体促进 mtDNA 周转：Retromer 复合物的主要功能之一是促进早期内体向晚期内体 / 溶酶体的成熟。研究人员通过研究小 GTP 酶 RAB10 的不同等位基因发现，mtDNA 复制应激会增强 RAB10 与 Retromer 的结合，激活依赖溶酶体的降解途径。RAB10 的活性形式 RAB10^Q68L能够促进线粒体碎片化和 mtDNA 降解，而其显性负突变体 RAB10^T23N则无此作用，表明 mtDNA 复制应激的下游反应受 RAB10 - 活跃溶酶体的调控。
• 果蝇幼虫表皮中长 mtDNA 缺失的产生：为了在体内研究 Retromer 对 mtDNA 质量控制的影响，研究人员利用 Gal4 / 上游激活序列（UAS）果蝇模型，通过共表达线粒体靶向的限制性内切酶 Afl III（mitoAfl III）和噬菌体 T4 的 DNA 连接酶（mitoT4lig），成功在果蝇 mtDNA 中产生了 2564 碱基对的缺失。这一操作导致 mtDNA 异质性增加，线粒体功能受损，为后续研究 Retromer 的作用提供了理想的模型。
• VPS35 促进体内 mtDNA 的清除：研究人员在果蝇幼虫表皮中过表达 Vps35，发现其能够恢复 mtDNA 的同质性，改善线粒体功能。在携带 mtDNA 缺失的果蝇模型中，过表达 Vps35 后，mtDNA 拷贝数和异质性得到了显著改善，线粒体超微结构也恢复正常，表明 VPS35 在体内能够有效促进 mtDNA 的清除，减轻线粒体负担。
• VPS35 表达逆转 ΔmtDNA 幼虫表皮的转录组谱：对 ΔmtDNA 果蝇幼虫表皮进行转录组分析发现，mtDNA 缺失导致线粒体相关 mRNA 水平降低，同时激活了蛋白水解、先天免疫反应和氧化还原控制等多条通路。而过表达 Vps35 能够逆转这些基因表达的变化，使转录组谱恢复正常，进一步证明了 VPS35 在改善 mtDNA 损伤相关缺陷中的重要作用。
• VPS35 升高支持溶酶体功能而不影响巨自噬：在人类细胞实验中，研究人员发现过表达 VPS35 能够增加酸性颗粒的数量，增强溶酶体功能，但对一般的自噬途径，包括整体线粒体自噬（bulk mitophagy）没有影响。这表明 VPS35 主要通过刺激溶酶体功能，加速线粒体成分的逐片清除，从而促进 mtDNA 损伤后的恢复。

综合上述研究结果，研究人员揭示了 mtDNA 复制应激下线粒体基因组的降解机制。mtDNA 复制应激引发了一系列复杂的下游反应，包括线粒体碎片化、MDVs 的形成以及 mtDNA 通过 BAX 依赖的途径转运至回收细胞器。Retromer 在这一过程中发挥了关键作用，它不仅促进线粒体碎片化和 MDVs 的形成，还协助 mtDNA 的转运和降解。在果蝇模型中也证实，过表达 Retromer 的核心成分 VPS35 能够有效改善 mtDNA 损伤相关的缺陷，恢复线粒体功能和细胞转录组谱。这一研究成果为深入理解线粒体质量控制机制提供了新的视角，也为治疗与 mtDNA 损伤相关的疾病提供了潜在的干预靶点，具有重要的理论意义和临床应用价值。