综述：探究细胞内力学的新兴机械生物学技术

《npj Biological Physics and Mechanics》：Emerging mechanobiology techniques to probe intracellular mechanics

这篇综述聚焦于研究细胞内力学的前沿技术，介绍了光遗传学、布里渊显微镜等六种先进技术，它们能在更高时空分辨率下研究亚细胞成分的物理性质，有助于深入理解细胞迁移、代谢等过程中的机械生物学机制。

　　

引言

在生命科学领域，细胞就像一个个精密而复杂的微观工厂，执行着各种维持生命运转的功能。而这些功能的实现，很大程度上依赖于细胞自身以及所处环境的机械性能。机械生物学这一前沿学科，专注于探究细胞如何感知物理信号和力，并将机械信号转化为生化反应。过去，科学家们在细胞整体层面研究细胞力学方面成果颇丰，但随着技术的进步，如今深入到细胞内部，研究亚细胞水平的机械转导成为可能。这就好比从研究一座城市的整体布局，深入到探究城市中每一栋建筑内部的精细结构和运作机制。

研究亚细胞成分（如细胞器和细胞质）的物理性质，对理解细胞力学至关重要。例如在癌症研究中，癌细胞的物理性质（如细胞粘度）变化与转移潜能增加密切相关。而且，精确测量这些物理性质，能为生物过程的计算机模型提供更准确的数据，就像为虚拟城市的建设提供更精确的建筑参数一样。

本文将着重介绍六种先进的实验技术，它们在空间和时间分辨率上有显著提升，为细胞内力学研究打开了新的大门。

力发生器：在细胞内施加力的方法

光遗传学

光遗传学（Optogenetics）是一项极具创新性的技术，它利用光来精确控制活细胞中特定蛋白质的表达和定位，实现对细胞功能在空间和时间上的精准调控。这一技术的核心是一对关键组件：一个是光照后会改变构象的光敏蛋白，另一个是与光敏蛋白相互作用的目标蛋白。以 Cry₂/CIB₁和 iLID/SspB 这两对组件为例，光敏蛋白可被设计成细胞器特异性的 “锚定蛋白”，定位到特定的细胞区室。通过控制光照模式，就能像精准导航一样，在亚细胞水平精确激活目标蛋白。光遗传学涉及的物理量包括光照区域的面积、光照时长、强度以及光敏蛋白浓度等。其激活速度极快，通常在亚秒级，而且在激发光束移除后，效果还能持续几分钟。

在一项研究中，光遗传学被用于探究内质网（ER）的机械敏感性。研究人员利用 LIMER（光诱导内质网特异性机械刺激器），通过向内质网照射蓝光（470nm），招募分子马达（修饰的驱动蛋白 - 1），使内质网发生收缩。他们推测这种收缩可能会打开内质网膜上的机械敏感离子通道，促使钙离子（Ca²⁺）释放。为了验证这一假设，研究人员使用了 GCaMP6（一种基因编码的钙指示剂）来监测钙离子变化，并通过应用 TRPV1 拮抗剂和对 PKD2 进行基因敲低实验，发现离子通量显著减少，从而证实了内质网的机械敏感性。

光遗传学的优势明显，它能在空间上通过光照区域精确控制蛋白激活，时间上激活速度快，还能在体内进行实验，对细胞无明显损伤，且激活过程不会干扰其他生物过程。不过，建立稳定表达光遗传构建体的细胞系，需要复杂的分子生物学操作。而且在一些复杂介质（如人脑）中，光的穿透性会受到影响，限制了激活光子的空间分辨率。

细菌细胞和纳米机器人

在一项有趣的研究中，活细菌细胞被用作一种独特的力传递机制。志贺氏菌（Shigella flexneri）能够利用宿主细胞的细胞骨架肌动蛋白，通过聚合作用在真核细胞质中快速移动，速度可达 0.5μm/s。在移动过程中，细菌会与线粒体网络等细胞器发生碰撞，引发线粒体裂变。这种方法为研究细胞器在拥挤的细胞环境中如何避免相互作用的灾难性后果提供了新视角。

然而，利用自由移动的活细菌来传递细胞内力，存在一些局限性。细菌运动方向随机，每次碰撞产生的力大小不一，这使得实验的可重复性和定量性较差。不过，可以通过与其他技术结合来改进，比如利用光遗传学调节细菌的肌动蛋白聚合机制，控制其运动方向和速度；或者使用光学镊子设定细菌的初始位置。

与细菌细胞类似，纳米机器人在生物医学领域应用广泛，但在细胞内力学研究方面相对较少被探索。磁性驱动纳米电机（MPN）是一种螺旋状、由生物相容性材料制成的纳米机器人，可在旋转磁场的引导下移动。原则上，它可以用于探测细胞内的机械性质，比如通过与光学镊子中的微珠接触来校准。此外，一些纳米机器人利用光热材料将近红外光转化为热能来实现推进，它们形态各异，有球形、海胆状或花状等。但这些纳米机器人也存在与磁颗粒类似的问题，即容易受外部场的影响，难以实现复杂的轨迹运动。

光镊

光镊（Optical tweezers，OT）是一种在生物学研究中应用广泛的技术，可用于从体外单个蛋白质到活细胞内细胞器等多个尺度的研究。在细胞内力学研究中，光镊通常使用直径约 1μm 的化学惰性介电微珠，有时也会利用内源性的密集颗粒（如脂滴）。当激光束聚焦在微珠上时，微珠会散射入射光，如果微珠偏离陷阱中心，散射光会推动微珠回到陷阱中心。这一过程使用红外激光，既不会损伤活细胞，也不会干扰荧光成像。在低位移情况下，光镊表现得像一个胡克弹簧，其施加的力 F 与微珠偏离陷阱中心的位移 Δx 成正比，即 F = kΔx（k 为弹簧刚度）。

光镊在细胞内力学研究中具有双重用途，既可以作为力发生器，向细胞内的细胞器施加力，也可以作为刚度传感器，测量细胞内的弹性和粘性等流变性质。例如，通过将陷阱向细胞器移动或在细胞质中移动，追踪微珠相对于陷阱中心的位置变化，就可以测量细胞质的粘弹性。光镊还被用于研究不同细胞骨架抑制剂对高尔基体刚度的影响，以及通过按压内质网触发钙离子释放等实验。

光镊技术的优点是微创性强，微珠能被多种细胞自发内化，且化学惰性的微珠在细胞内移动不会对细胞造成明显损伤。结合活细胞荧光成像，光镊可以在局部尺度（微珠大小，约 1μm）对特定细胞器施加力或测量其流变性质。但光镊也有局限性，它无法在亚微米水平施加或测量力，而且在测量细胞器刚度时，细胞质的拥挤效应会影响微珠运动，增加了测量流变学量的难度。

力传感器：测量细胞内的力和流变学的方法

光镊

除了作为力发生器，光镊在测量细胞和细胞内流变学方面也发挥着重要作用。通过移动陷阱，让微珠与细胞器或在细胞质中移动，当遇到障碍物时，微珠相对于陷阱中心的位置会发生变化，这种变化与障碍物的刚度相关。研究人员利用光镊以这种方式研究了细胞质的粘弹性，还通过按压内质网触发钙离子释放，并观察其变化。与原子力显微镜（AFM）不同，光镊可以在活细胞中对细胞核进行压痕实验，从而量化哺乳动物细胞和斑马鱼细胞中细胞核的局部粘弹性性质。

布里渊显微镜

布里渊显微镜（Brillouin microscopy）是材料科学领域的一项成熟技术，近年来在生物系统研究中也得到了广泛应用。其原理基于布里渊散射，即光与声子相互作用，使散射光的频率发生偏移。声子是由材料内部分子热振动产生的自发声波。通过测量散射光的频率偏移，可以计算出细胞成分的纵向模量（M）。M 与杨氏模量类似，但它还考虑了材料在拉伸或压缩时垂直方向的收缩或膨胀。虽然 M 与杨氏模量 E 的精确关系并不总是容易确定，但 M 与体积模量 K 和剪切模量 G 之间存在简单关系：M = K + 4/3G。

布里渊显微镜的优势在于它是一种无标记、非破坏性和非侵入性的技术，具有亚微米分辨率，能够研究核膜、核仁、细胞质等亚细胞结构的力学性质。它已成功应用于多种生物系统的研究，如角膜晶状体、动脉粥样硬化斑块、细菌脑膜炎、细胞骨架、蜘蛛丝、牙本质以及细胞和组织等。不过，在生物样本中，感兴趣区域的折射率和密度可能不均匀，虽然这对纵向模量 M 的影响较小，但布里渊显微镜需要高分辨率光谱仪来检测微小的频率偏移，对光学组件的精确对准和先进的计算工具要求较高，以分析和解释数据。

张力探针

F?rster 共振能量转移（FRET）传感器是一种用于研究细胞内机械敏感模块（如细胞 - 底物粘附、细胞 - 细胞粘附或细胞核）内分子间张力的成像技术。它涉及两个荧光团：一个供体荧光团被成像系统的激光激发，另一个受体荧光团通过能量转移被供体激发并负责发射荧光。两个荧光团的接近程度与发射强度相关，这使得 FRET 传感器非常适合用于检测细胞内的张力。

本文重点介绍膜嵌入张力探针的最新进展。例如，含有 FRET 传感器和 Laurdan 探针的脂质囊泡可用于测量膜张力；MSS（一种 FRET 系统）平行嵌入质膜可测量作用在细胞上的剪切应力；FRET 传感器还应用于 nesprin（核骨架和细胞骨架连接复合物 LINC 的组成部分），以研究细胞核的机械转导。

Flipper 探针是一种相对较新的技术，由含有环状基团的长有机分子组成，可插入活细胞和细胞器的膜中，提供有关脂质堆积的信息，而脂质堆积与脂质组成和膜张力都有关系。目前已有针对内质网、溶酶体和线粒体等细胞器的商业化 Flipper 探针。成像 Flipper 探针使用荧光寿命成像显微镜（FLIM），它测量荧光分子在激发态停留的时间（荧光寿命，通常为 0.1 - 100ns）。Flipper 探针在 488nm 处激发，在 600nm 左右收集发射光，其荧光寿命通常为 2 - 7ns。当膜张力变化时，Flipper 分子两端的供体和受体荧光团会发生扭转，这种扭转会影响荧光寿命，从而可以通过 FLIM 测量膜张力变化。

Flipper 探针能够实时、无创地在体内收集定量数据，应用于细胞时操作相对简单，只需将探针以微摩尔浓度孵育数小时即可。通过 HaloTag 技术对探针进行化学修饰，还可以实现细胞器特异性检测。但 Flipper 探针也存在缺点，除了对硬件和实验 FLIM 设置要求较高外，生物系统的细胞膜成分高度动态变化，脂质组成的改变也会影响探针的荧光寿命。不过，可以利用不同的时间尺度来解决这个问题，因为 Flipper 探针能实时响应膜张力变化，而脂质组成变化通常需要几分钟的时间尺度。

磁颗粒

磁颗粒在生物学中应用广泛，可作为探测器或用于细胞分离等。细胞内的磁颗粒可以通过外部磁场控制，改变磁场的方向或大小就能调节吸引力或排斥力。与光镊类似，细胞内的磁颗粒既可以作为力发生器，也可以作为力传感器。微米大小的磁颗粒可以报告皮升体积内凝胶和液体的流变性质，不同细胞类型的有效粘度测量值在 0.1 - 1Pa?s 之间。磁颗粒可以自发内化进入细胞，被内吞形成磁性内体，也可以注射到活细胞的细胞质（如果蝇胚胎）或细胞核中。

各向异性顺磁探针与外部磁场相互作用的技术称为磁旋转光谱（MRS），它已被用于复杂流体的微观流变学研究，并越来越多地应用于细胞内研究。例如，内化到活细胞中的微米大小的磁性线可用于实时测量细胞质的流变性质。通过外部磁场以不同速度旋转磁性线，会使磁性线从稳定运动转变为受阻运动，这种转变是粘弹性材料的典型特征。磁颗粒还可以用于研究细胞内细胞器的力学性质，如利用铁蛋白磁性纳米颗粒探测染色质的力学性质。

磁颗粒化学惰性强，对细胞活力无影响，通常能自发内化进入细胞。在组织研究中，较小的铁磁流体可以直接注射到生物体中或被细胞内吞。外部磁场不会与细胞内源性成分相互作用，并且磁场力向量可以轻松调节以满足不同实验需求。但与光遗传学或光镊等技术相比，磁颗粒的空间精度较低，因为它们只能朝着或远离磁铁移动，或者旋转。不过，几十纳米大小的磁性纳米颗粒的发展，为在更小尺度上研究染色质力学等提供了可能。

结论与展望

与传统的细胞拉伸、原子力显微镜、渗透压冲击、细胞拉伸器和微流控装置等方法相比，本文介绍的六种新兴细胞内技术在施加局部力和测量流变性质方面更加精确。但这些技术之间也存在重要差异。每种技术的实施都需要特定的专业知识，从构建稳定光遗传细胞系所需的分子生物学知识，到制造纳米机器人的化学合成知识，再到布里渊显微镜所需的光学组件和数据分析知识等。而且，这些技术都具有微创性，通常不会干扰细胞的正常生长，并且与生物过程正交，不会影响其他生理过程。

从力施加和力测量的空间控制角度来看，光遗传学和 Flipper 探针等光学技术具有细胞器水平的精度，因为它们都含有特定于细胞器膜的功能基团。但这种高度特异性和潜在的高通量缺乏灵活性，若要在不同细胞器上进行相同实验，需要构建全新的结构。而基于颗粒的技术（如磁颗粒、细菌 / 纳米机器人或光镊）则不同，颗粒内化进入细胞后会分布在细胞质的不同位置。这种方法的缺点是，为了研究特定细胞器，需要扫描大量细胞，以找到探针位于感兴趣亚细胞成分附近的细胞，因此本质上通量较低。光镊在三维空间中的移动范围最广，磁颗粒则只能朝着或远离给定起点移动。布里渊显微镜则兼具两者的优点，具有亚细胞器水平的空间精度，还能同时高通量地研究不同类型的细胞器。此外，磁颗粒和光镊既可以作为力发生器，又可以作为流变学传感器，这在选择研究细胞内力学的技术时具有很大的实用优势。相比之下，光遗传学、细菌和纳米机器人仅作为力发生器，Flipper 探针和布里渊显微镜仅作为流变学传感器。

总体而言，这六种技术单独使用或组合使用，都有望在未来几年显著推动我们对细胞内力学的理解，为生命科学和健康医学领域的研究开辟新的道路，帮助我们更深入地探索细胞微观世界的奥秘。