基于Sulphostin结构改造的N-磷酸哌啶酮：选择性共价抑制DPP8/DPP9的创新策略

《Nature Communications》：Sulphostin-inspired N-phosphonopiperidones as selective covalent DPP8 and DPP9 inhibitors

编辑推荐：针对DPP8/DPP9选择性抑制难题，研究人员以天然产物Sulphostin为模板，设计出N-磷酸哌啶酮衍生物，通过结构优化获得IC50达14 nM的高选择性抑制剂，结合X射线晶体学和化学蛋白质组学验证其共价结合机制，为炎症和癌症治疗提供新型靶向工具。

　　

在蛋白酶抑制剂研发领域，二肽基肽酶8和9（DPP8/DPP9）作为细胞内丝氨酸水解酶，因其在炎症和癌症中的关键作用而成为重要靶点。然而，由于与同源酶DPP4的高度结构相似性，开发选择性抑制剂面临巨大挑战。现有抑制剂如Val-boroPro（VbP）和1G244虽有一定效果，但普遍存在选择性不足、细胞毒性或作用机制不明等问题。更棘手的是，这些化合物在完整细胞中的靶点参与度和蛋白组选择性数据严重缺乏，极大限制了其临床应用潜力。

德国杜伊斯堡-埃森大学Markus Kaiser团队联合多国科研人员，在《Nature Communications》发表了一项突破性研究。该工作从链霉菌天然产物Sulphostin出发，通过创新性结构改造，开发出具有优异选择性的DPP8/DPP9共价抑制剂。Sulphostin作为已知DPP4抑制剂（IC₅₀ 21 nM），其独特的磷酸磺酰胺结构和(S)-3-氨基哌啶-2-酮骨架引起了研究者注意。研究首次揭示该化合物通过Walden反转机制共价修饰DPP4/8/9活性位点丝氨酸，为后续理性设计提供了关键模板。

研究采用多学科技术方法：通过化学合成获得Sulphostin及其衍生物；运用酶动力学测定IC₅₀和k_inact/K_I参数；采用天然质谱（nMS）验证共价修饰；借助X射线晶体学解析DPP9-抑制剂复合物结构（分辨率达1.89?）；利用基于氟磷酸盐探针（≡FP）的竞争性活性蛋白质组分析（ABPP）评估蛋白组选择性；通过邻近连接实验（PLA）和细胞活力检测验证细胞内靶点参与。

"Sulphostin covalently inhibits DPP4/8/9"章节显示，重合成的Sulphostin对DPP4/8/9表现出差异抑制（IC₅₀分别为79 nM/6.93 μM/1.39 μM）。nMS检测到+155 Da和+311 Da质量偏移，证实磷酸磺酰胺部分共价结合。时间依赖性动力学分析揭示其不可逆抑制特性，k_app值显示对DPP4优先结合（36,963 M^-1s^-1）。

"Structural analysis"部分通过1.89?晶体结构阐明作用机制：催化丝氨酸S₇₃₀发生S_N2(P)亲核攻击，伴随磷原子构型反转。(S)-3-氨基哌啶-2-酮作为离去基团，其氨基与EE螺旋的E248/E249形成离子对，模拟天然底物N端结合模式。

"Proteome-wide selectivity"通过ABPP证明Sulphostin在50μM浓度下仅显著竞争DPP8/9标记（21个≡FP靶标中），展现优异类选择性。这促使研究者设计膜渗透性更好的N-磷酸哌啶酮衍生物。

在"Sulphostin-inspired derivatives"开发中，C₁₂烷基衍生物8对DPP8抑制达96 nM（21倍DPP9选择性）。引入芳环的化合物16表现最优，对DPP8的IC₅₀为14 nM（1154倍DPP4选择性），k_app达51,249 M^-1s^-1。2.49?晶体结构证实其共价结合模式与母体化合物一致，戊基苯硫基乙基部分占据S2口袋。

"Target engagement"实验显示，化合物16可剂量依赖性减少MMC诱导的DPP9-BRCA2相互作用（PLA检测），并增强细胞对基因毒性的敏感性，且无1G244的脱靶毒性。ABPP证实其仅显著标记DPP9和微量PREP（IC₅₀>50μM），展现卓越选择性。

该研究创新性地证明：通过精细调控离去基团结构可实现外肽酶的选择性抑制，打破了传统磷酰胺类抑制剂的设计范式。所开发的N-磷酸哌啶酮不仅为研究DPP8/9在炎症和DNA修复中的功能提供优质工具，其"反应弹头-选择性过滤器"协同设计策略更为共价药物开发开辟新途径。这项成果将推动针对DASH家族蛋白酶的特异性抑制剂研发，对癌症和自身炎症疾病的治疗具有重要转化价值。