冷冻电镜解析金黄色葡萄球菌 WTA 转运蛋白 TarGH 的作用机制及 targocil-II 抑制机制：为抗耐药菌感染药物研发提供关键依据

《Nature Communications》：Cryo-EM analyses unveil details of mechanism and targocil-II mediated inhibition of S. aureus WTA transporter TarGH

为解决金黄色葡萄球菌（S. aureus）耐药性导致的治疗难题，研究人员开展了对S. aureus中 WTA 转运蛋白 TarGH 机制及 targocil-II 抑制作用的研究。通过冷冻电镜（cryo-EM）等技术，揭示了 TarGH 结构、targocil-II 结合位点及抑制机制，为研发抗耐药菌感染药物提供了依据。

　　在当今全球健康领域，抗菌耐药性（AMR）无疑是一场可怕的危机。世界卫生组织（WHO）已将 ESKAPEE 细菌病原体列为研发治疗药物的关键目标，其中金黄色葡萄球菌（S. aureus）作为常见的医院病原体，引发的感染治疗面临诸多困境 。传统治疗S. aureus感染的药物，如四环素、环丙沙星和 β- 内酰胺类药物，因细菌耐药性问题效果大打折扣。尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌，给临床治疗带来巨大挑战，迫切需要开发针对细菌其他酶活性的新型抗生素。

在S. aureus的细胞结构中，细胞壁磷壁酸（WTA）起着至关重要的作用。WTA 是一种多醇磷酸聚合物，修饰革兰氏阳性细菌的肽聚糖，在细菌细胞分裂、致病过程以及 β- 内酰胺耐药性等方面都有重要影响 。WTA 的生物合成过程中，由 TarGH 这种 V 型 ABC 转运蛋白将脂质连接的前体翻转穿过细胞膜，这一过程对 WTA 合成至关重要，同时 TarGH 在S. aureus中具有不可替代性，其基因缺失会导致细菌无法存活，且 TarG 在细菌细胞表面可及，使其成为极具潜力的药物开发靶点。此前虽已发现 targocil 和 targocil-II 等 TarGH 抑制剂，但缺乏高分辨率的结构信息，限制了对其作用机制的理解和进一步的药物研发。

来自加拿大英属哥伦比亚大学（University of British Columbia）等机构的研究人员，针对这一现状开展了深入研究。他们通过冷冻电镜（cryo-EM）技术，对S. aureus的 TarGH 在不同状态下进行结构解析，包括与 ATP 类似物、有序二糖洗涤剂月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG）以及 targocil-II 结合的状态。研究成果发表在《Nature Communications》上，为深入理解 TarGH 的作用机制和 targocil-II 的抑制机制提供了重要依据，为开发针对耐药菌感染的新型治疗方法奠定了基础。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是蛋白质表达与纯化技术，将S. aureus的 TarG 和 TarH 在大肠杆菌（E. coli）或乳酸乳球菌（L. lactis）中进行共表达并纯化；二是冷冻电镜技术，制备不同条件下的 TarGH 样本，进行冷冻电镜数据采集和处理，以获得高分辨率的结构；三是酶活性测定和结合实验，利用孔雀石绿比色法测定 TarGH 的 ATPase 活性，通过微尺度热泳法（MST）检测 targocil-II 与 TarGH 的结合亲和力，还进行了革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度（MIC）测定实验。

Production and in vitro characterisation of S. aureus TarGH：研究人员将来自耐甲氧西林S. aureus临床菌株 USA300 的全长 TarG 和 TarH 在E. coli或L. lactis中进行共表达，获得的 * TarG₂H₂* 异源四聚体经凝胶电泳和尺寸排阻色谱结合多角度静态光散射进行验证。从革兰氏阴性和阳性表达系统获得的复合物在溶解、寡聚化和活性方面表现相似，均具有一致的 ATPase 活性。这表明不同表达系统对 TarGH 的基本性质影响较小，为后续研究提供了稳定的样本来源。

TarGH is a type V ABC transporter with an internal electropositive cavity compatible with WTA polymer binding：通过冷冻电镜技术，研究人员解析了S. aureus TarGH 与 ATPγS 结合的 2.3 ? 高分辨率结构。TarGH 属于 V 型 ABC 转运蛋白，每个 TarG 跨膜结构域（TMD）由六个跨膜螺旋等组成，两个 TarG 原聚体形成一个内部空腔，其尺寸和电正性与带负电的 WTA 聚合物底物互补。TarH 核苷酸结合结构域（NBD）由 RecA 型 ATP 结合核心等组成，包含多个参与 ATP 结合和水解的功能基序，还发现了一个额外的脂质翻转酶特异性门控基序（GM）。这一结构特征揭示了 TarGH 与 WTA 底物结合的结构基础，为理解其转运机制提供了关键信息。

Ordered LMNG glycolipids suggest potential binding sites of the WTA substrate at both cytoplasmic and extracellular faces of TarGH：在 ATPγS 结合状态下，研究人员观察到三个有序的 LMNG 分子。两个位于细胞质侧，结合在 TarH 的 GM、TarG 的 IFc 和 LG 环形成的楔形裂隙中；另一个位于细胞外表面，在 TarG 二聚体旋转轴上。LMNG 的结合位置可能反映了 WTA 底物翻转前后的结合位点，为推测 WTA 底物的转运路径提供了线索。

The TarH D-loop adopts a catalytically incompetent conformation when bound to ATPγS：2.3 ? 分辨率的结构显示，TarH 的 D 环在与 ATPγS 结合时处于催化无活性的构象。ATPγS 与 ABC 基序相互作用，但催化惰性的 r -（硫代）磷酸与 His201 形成氢键和静电相互作用，而 Walker B 中的 Asp168 距离镁离子过远，无法直接与之相互作用，Glu169 的侧链密度缺失。D 环的构象变化导致活性位点结构不利于 ATP 水解，同时形成了一个溶剂暴露的细胞质通道。这一发现揭示了 TarGH 在无底物时避免 ATP 无效水解的一种机制。

Inhibitor targocil-II binds to the extracellular site of TarG：targocil-II 通过高通量筛选和构效关系（SAR）优化开发而来，能抑制 TarGH 的 ATPase 活性，IC₅₀值为 6.5 ± 1.2 μM。冷冻电镜结构显示，targocil-II 结合在 TarG 二聚体的细胞外界面口袋中，与多个氨基酸残基相互作用。通过对耐药突变体和不同物种的研究发现，targocil-II 对S. aureus有强效抑制作用，但对枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）和肺炎链球菌（S. pneumoniae）无效，这与结合位点的氨基酸差异有关。该研究明确了 targocil-II 的结合位点和作用特异性，为后续药物优化提供了方向。

Targocil-II binding causes local and global conformational changes in TarGH：targocil-II 的结合与之前 ATPγS 结合状态下的 LMNG 结合位点重叠，但其结合诱导了 TarG 的 EL 环周围广泛的局部构象变化。同时，TarH 的 D 环从催化无活性的构象转变为典型的近螺旋构象（D_{loop ON}），导致 TarH 整体发生约 15° 的顺时针旋转，Q 环也发生显著重排，关闭了原聚体之间的中央通道。这些构象变化使 TarH 的活性位点处于催化活性状态，表明 targocil-II 的结合通过变构调节影响了 TarGH 的 ATPase 活性。

研究结论和讨论部分指出，TarGH 在S. aureus的 WTA 转运过程中起着核心作用，冷冻电镜结构揭示了其在不同状态下的构象变化。D_{loop OFF}和 D_{loop ON}结构表明 TarH 活性位点在 ATPase 催化循环中能够发生显著构象变化，D_{loop OFF}状态可能是一种避免在无底物时 ATP 浪费的机制。结合的 LMNG 和 targocil-II 提示了 WTA 底物的潜在结合位点，targocil-II 可能模拟了底物的结合，但其抑制 TarGH 的机制可能是通过阻断底物进入细胞外结合位点或干扰 ATPase 水解循环的构象变化。

这项研究的重要意义在于，为理解S. aureus的 WTA 转运机制和 targocil-II 的抑制作用提供了原子水平的详细信息，为基于结构的药物设计提供了模板。由于 targocil-II 结合位点在其他革兰氏阳性病原体中相对保守，这一研究成果为开发针对耐药菌感染的新型抗感染药物带来了希望，有望解决当前严峻的抗菌耐药性问题，为临床治疗提供更有效的手段。