综述：细胞焦亡分子机制及其在疾病中的作用

《Cell Research》：Pyroptosis: molecular mechanisms and roles in disease

这篇综述聚焦细胞焦亡（pyroptosis），详细阐述了其发现历程、gasdermin 蛋白家族激活机制、细胞焦亡形态特征、在疾病中的作用及治疗靶点。研究表明细胞焦亡参与免疫防御与疾病进程，为相关疾病治疗提供新思路，值得深入研读。

　　

细胞焦亡的发现之旅

在细胞的 “生死世界” 里，细胞死亡曾被简单分为凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。凋亡是细胞有序的 “自我了断”，由特定信号通路调控，激活半胱天冬酶（caspases）家族中的凋亡相关 caspase，过程中细胞膜保持完整，通常被认为是免疫沉默的。坏死则是细胞在外部因素（如细胞损伤、毒素）作用下被动、无序的裂解，会释放细胞内的危险信号，引发炎症反应。

随着研究的深入，过去二十年发现了多种新的细胞死亡方式，模糊了程序性细胞死亡和坏死的界限，细胞焦亡就是其中备受瞩目的一种。细胞焦亡最早可追溯到 20 世纪 90 年代初，当时人们发现炭疽芽孢杆菌毒素或福氏志贺菌感染会导致巨噬细胞死亡。起初，由于在福氏志贺菌感染的细胞中检测到 DNA 片段化，这种死亡被误认为是凋亡。但后续研究发现，它与凋亡有诸多不同，比如没有典型的细胞核浓缩现象，还会导致细胞膜通透性改变和坏死形态。直到 1996 年，研究证实这种新型细胞死亡依赖于炎症性 caspase - 1，而非凋亡相关的 caspases，并且会伴随成熟的白细胞介素（IL） - 1β 和 IL - 18 释放。2001 年，“细胞焦亡” 这一术语正式诞生，源于希腊语 “pyro”（意为火或发热）和 “ptosis”（意为下降），强调了其促炎特性。

与此同时，炎症小体（inflammasome）的分子特征被揭示。炎症小体是由模式识别受体（PRRs）在检测到病原体相关分子模式（PAMPs）或内源性危险信号（DAMPs）后组装而成的信号复合体，可激活 caspase - 1。经典炎症小体由 Pyrin、AIM2、CARD8 和多个 NOD 样受体（NLR）家族成员组装激活 caspase - 1；非经典炎症小体途径则在 2011 年被报道，可激活小鼠的 caspase - 11 或人类的 caspases - 4 /- 5 。最初，细胞焦亡被定义为炎症小体依赖的细胞死亡和炎症小体的效应机制，但当时活性 caspase - 1、 - 11 或 - 4 诱导细胞死亡的具体机制并不清楚。

直到 2015 年，里程碑式的研究发现 gasdermin D（GSDMD）是细胞焦亡的关键执行者。GSDMD 是 gasdermin 蛋白家族成员，人类有 6 种（GSDMA、 - B、 - C、 - D、 - E 和 - F，F 也称为 pejvakin，PJVK），小鼠有 10 种（GSDMA1 - 3、GSDMC1 - 4、GSDMD、GSDME 和 PVJK） 。研究发现，caspase - 1、 - 11 或 - 4 可在 GSDMD 中央连接域的天冬氨酸残基（人类为 D275，小鼠为 D276）处切割，产生 31 - kDa 的 N 端片段（GSDMD - NT）和 22 - kDa 的 C 端片段（GSDMD - CT） 。表达 GSDMD - NT 会诱导具有细胞焦亡特征的细胞毒性，而全长 GSDMD（GSDMD - FL）或 GSDMD - CT 则对细胞活力无影响，这表明 caspase 介导的切割使 GSDMD - NT 从 GSDMD - CT 的分子内自抑制中释放出来。此后，gasdermin 家族被认为是一类新的细胞死亡效应因子，其 N 端结构域（GSDM - NT）可诱导细胞焦亡。

细胞焦亡的分子机制：gasdermin 蛋白的 “穿孔行动”

细胞焦亡的核心机制与 gasdermin 蛋白家族密切相关。以 GSDMD 为例，被 caspase 切割后，GSDMD - NT 会与细胞膜结合，它偏好结合酸性磷脂，如质膜内小叶的磷脂酰肌醇，心磷脂也是其强结合物，这意味着它还可能作用于线粒体或细菌膜。脂质体结合实验证实 GSDMD - NT 能与膜相互作用并使其通透，原子力显微镜和电子显微镜分析显示，GSDMD - NT 在膜上形成平均内径约 20nm 的孔状结构 。

目前，gasdermin 蛋白的自抑制和孔形成机制在分子层面已得到深入研究。全长 mGSDMA3 和 m /hGSDMD 的结构显示，GSDM - NT 由扭曲的 β - 片层、α - 螺旋和参与膜插入的无序区域组成，而 GSDM - CT 主要由紧密堆积的 α - 螺旋构成。在全长蛋白中，GSDM - CT 会结合并掩盖 GSDM - NT 的膜结合元件，起到自抑制作用。蛋白水解切割分离 N 端和 C 端是解除自抑制、促进 GSDM 激活的主要机制。炎症性 caspases 在切割 GSDMD 时，会先与 GSDMD - CT 内的一个外位点相互作用，帮助将 GSDMD 的结构域间切割位点定位到 caspases 的催化位点附近。不过，目前对于靶向该外位点识别能否抑制 GSDMD 切割，以及其他蛋白酶切割 gasdermin 家族其他成员的机制仍有待研究。

研究还发现，重组 gasdermin N 端形成的孔具有冠状环和跨膜 β - 桶环结构，由 GSDM - NT 结构域的大球状亚结构域和两个并排的延伸 β - 发夹组织而成。不同 gasdermin 蛋白形成的孔，其原聚体数量不同，孔径也有所差异，如 GSDMA3 形成的孔由 26 - 28 个原聚体组成，内径为 18nm；GSDMB 形成的孔由 26 - 30 个原聚体组成，内径为 16nm；GSDMD 形成的孔由 31 - 34 个原聚体组成，内径为 21.5nm 。此外，还发现了非 β - 桶状孔结构，可能暗示着预孔结构的存在。在孔形成过程中，GSDM - NT 会发生重大构象变化，形状类似一只手，膜结合 α - 螺旋 1 像拇指，两个 β - 发夹像手指，其余部分形成手掌。

NINJ1：细胞焦亡的 “最终推手”

在细胞焦亡过程中，NINJ1（ninjurin - 1）起着关键的下游效应作用。早期对细胞焦亡的描述认为，细胞先形成小孔导致离子流动，随后细胞肿胀，最终细胞膜破裂。而近期研究表明，细胞膜破裂这一关键步骤是由 16 - kDa 的质膜蛋白 NINJ1 主动执行的。在缺乏 NINJ1 的情况下，细胞仍能诱导 GSDMD 切割和孔形成，可通过小 DNA 结合染料（如碘化丙啶，PI）的摄取来检测，但无法释放乳酸脱氢酶（LDH），而 LDH 常被用作细胞焦亡诱导的检测指标。同时，NINJ1 缺陷细胞在炎症小体激活时，仍能通过 GSDMD 孔释放 IL - 1β 和 IL - 18，这表明在没有细胞裂解的情况下，GSDMD 孔可作为蛋白质分泌的直接通道。不过，NINJ1 缺陷虽不能保护细胞免于死亡，但能有效阻止与裂解相关的 DAMPs（如 HMGB1 和 S100 蛋白）释放，这意味着缺乏 NINJ1 时细胞焦亡的促炎作用可能会减弱。

目前，激活 NINJ1 的信号尚不明确，也不清楚是否所有 gasdermin 蛋白都能触发 NINJ1 激活。不过，NINJ1 在多种坏死性死亡过程中均被激活，包括毒素诱导的坏死、铁死亡（ferroptosis）、铜死亡（cuproptosis），甚至凋亡细胞发生二次坏死时也会激活 NINJ1 。推测 NINJ1 可能感知细胞坏死时质膜性质的变化，如张力、流动性、脂质不对称性或脂质分布的改变。

一旦感知到激活信号，NINJ1 会形成高阶寡聚体。超分辨率显微镜和冷冻电镜对其进行了表征，发现 NINJ1 形成的柔性细丝具有疏水和亲水两面，其原聚体紧密排列成栅栏状的跨膜 α - 螺旋阵列。每个原聚体的结构部分包含 4 个 α - 螺旋，其中 α - 3 和 α - 4 完全穿过膜，α - 1 和 α - 2 形成一个扭结螺旋，α - 1 从一个原聚体跨越到另一个原聚体以稳定细丝。NINJ1 细丝的疏水和亲水两面使其能够覆盖并稳定膜边缘，形成大的跨膜损伤。也有研究提出，膜通透化可能涉及通过亲水表面相互作用形成的双细丝，细胞肿胀时逐渐像拉链一样打开。还有研究认为 NINJ1 通过 “膜损失” 模型形成损伤，即 NINJ1 寡聚体环绕膜斑块使其溶解。要确定哪种模型适用于 NINJ1 驱动的细胞膜破裂，还需要更多在细胞中可视化 NINJ1 诱导损伤的研究。此外，NINJ1 的同源物 NINJ2 在体外也能形成类似细丝，但不具备使细胞通透的能力，对 NINJ2 的研究或许能为理解 NINJ1 的作用机制提供帮助。

细胞焦亡的形态学特征：细胞的 “剧烈变身”

细胞焦亡在细胞层面会引发一系列显著的生化、代谢和形态学变化，这些变化使其与凋亡细胞有明显区别。凋亡细胞的特征是细胞核固缩（细胞收缩或凝聚，核紧凑度或密度增加）、膜起泡，并形成明显的凋亡小体，且细胞膜保持完整。而细胞焦亡始于 gasdermin 蛋白孔形成导致的细胞膜完整性丧失，这会引起钙、钠、钾离子的非特异性流动，破坏电化学梯度。

随后，细胞开始变圆、肿胀，通常会形成一个或几个大的膜泡。在此过程中，细胞核也会变圆、凝聚，线粒体和其他细胞器逐渐衰退，最终导致细胞代谢死亡。细胞焦亡时，质膜还会暴露磷脂酰丝氨酸（PS），这可能是由钙离子流动激活的 TMEM16F 介导的膜紊乱所致。最后，NINJ1 依赖的细胞膜完整性丧失，使细胞失去肿胀形态，NINJ1 通过形成孔或释放膜盘形成大的损伤。质谱研究表明，细胞会以 NINJ1 依赖的方式释放胞质和细胞器蛋白，这些蛋白可作为潜在的危险信号。近期研究还发现，NINJ1 损伤对于坏死细胞中的丝状肌动蛋白与树突状细胞中的 CLEC9A 信号相互作用是必需的。实验中，检测 NINJ1 诱导细胞裂解最简便的方法是测量细胞释放的 LDH 或摄取的大分子染料。但需要注意的是，在缺乏 NINJ1 时，细胞焦亡会进行到细胞肿胀阶段，细胞虽会死亡并通过 GSDM 孔摄取 PI 等染料，但 DNA 结合染料并不适合用于评估 NINJ1 损伤的形成。此外，细胞焦亡后还会释放细胞外囊泡（EVs），这些 EVs 可能由膜修复机制（如 ESCRT，可从膜上去除 GSDMD 孔）或其他过程产生，能够将信号传递给远处的细胞。

虽然细胞焦亡的这些变化都由 gasdermin 孔形成引发，且可在诱导表达 GSDM - NT 的细胞中重现，与上游切割并激活 gasdermin 的 caspases 无关。但在炎症小体激活的情况下，炎症性 caspases 不仅会切割 GSDMD，还会切割 pro - IL1β 和 - 18 。有趣的是，成熟形式的 IL - 1β 和 IL - 18 可在细胞裂解前从细胞焦亡细胞中释放出来，使用防止裂解的渗透保护剂或通过基因敲除 NINJ1 都能证明这一点，这表明在细胞膜完全通透前，GSDM 孔形成可能就与有限的胞质蛋白释放有关，但目前这种孔特异性分泌组尚未被描述和功能表征。另外，近期研究发现，除了蛋白质，细胞焦亡细胞还能释放氧脂素和代谢物，这些物质可促进组织修复。在某些情况下，炎症小体激活可诱导 IL - 1β 释放而不伴随细胞焦亡，这种现象称为超激活，说明 GSDM 孔形成可能有助于非传统的蛋白质分泌，且与细胞死亡无关。

目前对细胞焦亡的研究多集中在小鼠或人类巨噬细胞，但在其他细胞类型（如中性粒细胞、肠上皮细胞）中，细胞焦亡可能具有不同特征。虽然细胞焦亡的形态与凋亡细胞明显不同，但仅从形态上区分细胞焦亡与其他坏死过程（如坏死性凋亡、铁死亡）仍具有挑战性，因为膜完整性丧失、细胞变圆肿胀和最终的细胞膜破裂在坏死性细胞死亡形式中较为常见。因此，明确识别细胞焦亡需要将形态学分析与生化表征和基因敲除相结合，研究缺乏上游通路关键成分和 gasdermin 的细胞或动物，同时检测活性蛋白酶和 gasdermin 的切割情况。目前虽有一些抑制剂在特定情况下有用，但还没有选择性的 gasdermin 抑制剂。

gasdermin 蛋白的激活方式：开启细胞焦亡的 “钥匙”

gasdermin 蛋白的激活是细胞焦亡发生的关键，主要有以下几种方式：

• 蛋白水解切割激活：这是研究最为深入的激活机制，通过蛋白酶切割，将具有孔形成能力的 GSDM - NT 与调节性的 GSDM - CT 分离。在众多蛋白酶中，caspases 是 gasdermin 激活的关键调节因子。炎症性 caspases（如 caspase - 1、 - 11 和 - 4）可切割哺乳动物的 GSDMD 。值得注意的是，caspase - 1 在鸟类、爬行动物和两栖动物等缺乏 GSDMD 的动物中，可通过靶向 GSDMA 诱导细胞焦亡，因为 GSDMA 的连接域存在 caspase - 1 切割位点。另一类 caspases，即凋亡相关 caspases，也能切割 gasdermin 蛋白，这看似矛盾，因为它们通常被认为是凋亡（一种非坏死性、免疫沉默的细胞死亡形式）的执行者。例如，在小鼠巨噬细胞（而非人类巨噬细胞）中，caspase - 8 可在与炎症性 caspases 相同的残基处切割 GSDMD，将外源性凋亡重新导向细胞焦亡，有助于宿主抵御耶尔森菌感染。caspase - 8 还能切割 GSDMC，位点为 D365 或 D240 。近期研究发现，涉及 ZBP1、caspase - 8 和 GSDMC 的信号轴可导致细胞焦亡，进而影响小鼠 DSS 诱导的结肠炎后黏膜修复。除了起始 caspase - 8，执行 caspase - 3 /- 7 也可加工 GSDME 诱导细胞焦亡 。GSDME 的表达水平及其潜在的亚细胞定位在决定细胞是否发生细胞焦亡中起决定性作用。在巨噬细胞中，GSDME 可能靶向线粒体，促进细胞色素 c 释放，增强凋亡。在癌细胞系中，GSDME 的表达水平影响细胞在化疗药物处理后的死亡方式，许多癌细胞系下调了 GSDME 的表达。此外，颗粒酶（Granzymes）是由自然杀伤细胞（NK 细胞）和细胞毒性 T 细胞产生的一类死亡诱导蛋白酶，也能切割 gasdermin 蛋白。如 GrzA 可加工 GSDMB，GrzB 可加工 GSDME 。在中性粒细胞中，GSDMD 还可被弹性蛋白酶和组织蛋白酶 G 切割导致细胞死亡。而 GSDMA 的激活较为特殊，目前尚未发现哺乳动物酶能切割它，但酿脓链球菌的蛋白酶 SpeB 在感染过程中可切割并激活 GSDMA，诱导细胞焦亡和宿主防御。

• 功能获得性突变激活：一些突变可破坏 gasdermin 蛋白的分子内自抑制，使全长蛋白能够形成孔，从而引发炎症或细胞死亡。例如，小鼠 GSDMA3 的多个突变会干扰其自抑制界面 I 和 II，导致蛋白自激活，引发小鼠脱毛。人类 GSDME 的一些功能获得性变体（DFNA5）与常染色体显性遗传性听力损失有关，这种突变的自激活形式源于外显子 8 跳跃，导致 GSDM - CT 结构域截断，失去自抑制功能。由于耳蜗毛细胞中 GSDME 高表达，使其对突变 GSDME 等位基因引发的细胞焦亡尤为敏感。此外，DFNB59 的突变也与听力损失相关，但由于 DFNB59 未被证明能形成孔，其潜在机制尚不清楚。

• 翻译后修饰激活：翻译后修饰（PTMs）激活 gasdermin 蛋白是一个新兴的研究方向。目前在哺乳动物中仅有三项研究报道了不依赖切割的激活方式，而在真菌和低等动物中存在更多相关例子。例如，Du 等人发现，即使是不可切割的 GSDMD D275A 突变体，在炎症小体激活后也能诱导低水平的细胞焦亡和 IL - 1β 释放 。进一步实验表明，这与 GSDMD 在 C191 处的活性氧（ROS）依赖的棕榈酰化有关，棕榈酰化是一种促进 GSDM 膜结合的 PTM。不过，在该研究中，ROS 产生和 GSDMD 棕榈酰化位于炎症小体激活和初始 GSDMD 孔形成的下游，主要起到放大机制的作用。值得注意的是，许多研究使用 D275A / D276A GSDMD 作为对照，甚至构建