DeepPlant：开启植物 5 - 甲基胞嘧啶精准检测新征程，解锁植物表观遗传奥秘

《Nature Communications》：

为解决植物 CHH 甲基化检测中高甲基化阳性样本稀缺、跨物种通用性差及 R10.4 平台软件适配问题，研究人员开展基于深度学习的植物 5 - 甲基胞嘧啶（5mC）检测研究。结果显示 DeepPlant 显著提升 CHH 检测准确性，在多物种表现优异。该研究为植物表观遗传学研究提供有力工具。

　　在植物的微观世界里，DNA 甲基化，尤其是 5 - 甲基胞嘧啶（5mC），如同一位神秘的幕后调控者，掌控着众多关键的生命进程。它能调节基因表达，决定哪些基因开启或关闭；让调皮的转座子安静下来，维持基因组的稳定。与动物不同，植物的 5mC 存在于 CpG、CHG 和 CHH 三种序列环境中，其中 CHH 甲基化虽含量少，但在沉默转座子、保障植物发育和应对压力时发挥着不可或缺的作用。

以往，Bisulfite 测序（BS-seq）是检测 5mC 的常用方法，可它就像一个带着枷锁的舞者，受限于短读测序技术，在复杂重复的基因组区域，如着丝粒和转座子区域，难以准确施展拳脚，还会引入偏差，影响检测精度，特别是对 CHH 基序的检测。随着科技发展，牛津纳米孔测序（ONT）技术崭露头角，它能直接利用纳米孔测序信号，在天然长读长上检测 DNA 修饰，为研究带来新希望。此前开发的 DeepSignal-Plant 深度学习工具，虽在全基因组 5mC 检测上取得一定成果，但 ONT 新推出的 R10.4 FlowCell 在碱基识别上有了显著提升，可与之适配的软件却滞后了。已有的为 R9.4 平台开发的甲基化检测工具，如 Tombo、Megalodon 和 DeepSignal-Plant 都无法直接应用于 R10.4 FlowCell。而 ONT 为 Dorado 软件引入的新 5mC 检测模型，在检测植物中高甲基化水平的 CpG 和 CHG 时表现尚可，可面对 CHH 甲基化检测却力不从心，主要原因是训练用的阳性 CHH 样本有限。

为了突破这些困境，中山眼科中心、中山大学人工智能学院、上海第二工业大学等多机构的研究人员携手开展研究。他们深入挖掘公开的 BS-seq 数据集，筛选出富含高甲基化 CHH 位点的植物物种，像丹参（Salvia miltiorrhiza）、马铃薯（Solanum tuberosum）和蓖麻（Ricinus communis）等，并对这些物种进行测序，大大增加了 CHH 阳性样本数量，构建了涵盖 97.2% 以 CHH 基序为中心的 9 聚体上下文的综合训练数据集。同时，研究人员开发了 DeepPlant 这一深度学习工具。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先，从多种植物材料中提取 DNA，包括丹参的根、马铃薯的块茎、蓖麻的胚胎等，利用牛津纳米孔技术 ONT PromethION R10.4.1 平台进行测序，并使用 ONT 官方碱基识别器 Dorado 进行碱基识别和 5mC 修饰的检测。同时，对相同的基因组 DNA 进行 BS-seq，作为评估的参考标准。此外，通过筛选高置信度的位点用于模型训练，从不同物种的全基因组 BS-seq 分析中挑选符合特定甲基化频率标准的 CHH、CHG 和 CpG 位点。最后，基于这些数据构建并训练 DeepPlant 模型。

研究结果

1. 样本选择：研究人员分析了 10 种植物的 BS-seq 数据，挑选出高甲基化 CHH 位点比例高或 k-mer 上下文多样性大的样本，如马铃薯块茎、丹参根等。收集 7 种物种的组织样本进行 BS-seq，经分析后选择丹参、马铃薯和蓖麻的数据集进行模型训练，其组合数据集覆盖了 97.2% 的 9 聚体上下文。另外选取 6 种不同 CHH 甲基化水平的物种用于测试，为模型训练和评估提供了广泛且具代表性的基础。
2. 模型架构与训练：DeepPlant 采用三重编码器架构，结合 Bi-LSTM 和 Transformer 两种神经网络架构。通过对不同 k-mer 长度样本的训练测试发现，9 聚体样本训练的模型性能优于 Dorado，51 聚体模型虽准确率高但存在过拟合，最终确定 13 聚体 Bi-LSTM 模型为最优。同时，研究人员还训练了 CHG 和 CpG 检测模型。
3. 5mC 甲基化频率定量评估：在 6 个测试数据集上，测序深度为 30× 时，DeepPlant 与 BS-seq 的皮尔逊相关性（r）达到 0.705 - 0.838。对于 CHH 甲基化含量较高的物种，相关性超 0.80。与 Dorado 相比，DeepPlant 相关性更高，测序深度增加时，DeepPlant 相关性稳步提升，而 Dorado 在多数情况下下降。在 CHG 和 CpG 模型评估中，DeepPlant 也表现出色。
4. 单分子甲基化检测性能：在单分子甲基化检测方面，DeepPlant 在训练和测试数据集上均优于 Dorado。在平衡的完全甲基化和未甲基化样本数据集上，DeepPlant 的 F1 得分更高，假阳性率（FPRs）低于 6% ，而 Dorado 在部分物种上 FPRs 较高。通过 ROC 和 PR 曲线分析进一步证实了 DeepPlant 在单分子水平的优势。
5. 水稻着丝粒和转座子区域 CHH 甲基化分析：利用 DeepPlant 对水稻（Oryza sativa）的着丝粒区域进行分析，发现其能几乎完全描绘染色体 4、5、8 和 12 的着丝粒区域，在着丝粒和非着丝粒区域的 CHH 位点覆盖度均优于 BS-seq。在分析水稻着丝粒转座子时，发现不同类型转座子的 CHH 甲基化水平存在差异，且部分转座子有链偏向性。

研究表明，DeepPlant 能精准检测植物基因组中所有序列环境下的 5mC 修饰，尤其是 CHH 甲基化。它解决了现有方法的局限性，提升了对植物表观基因组的分析能力，能深入研究复杂重复基因组区域的甲基化模式。不过，DeepPlant 也存在一些不足，如计算效率不如 Dorado，高甲基化 CHH 样本稀缺问题仍未完全解决，还可能存在过拟合风险。未来可探索人工富集 CHH 甲基化样本的方法，整合其他数据以更全面地理解表观遗传调控。总体而言，DeepPlant 为植物表观遗传学研究提供了强大工具，有助于深入探索植物复杂的表观遗传景观，推动植物基因组调控、稳定性和适应性等方面的研究，为植物生物学和农业科学发展做出重要贡献。