酶促桦木还原新机制：[4Fe-4S]-OH2和 [8Fe-9S] 簇的氢原子转移作用

为深入理解 I 类苯甲酰辅酶 A 还原酶（BCRs）催化机制，研究人员对反硝化细菌的活性亚基进行研究。通过结构解析、光谱分析和 QM/MM 计算，揭示了非典型双立方烷 [8Fe-9S] 和活性位点水合 [4Fe-4S] 簇参与的自由基机制，为酶促或仿生桦木还原提供理论基础。

　　在化学合成领域，桦木还原反应至关重要。传统的桦木还原需在低温下将碱金属溶于液氨，利用产生的溶剂化电子实现芳烃的二氢加成，生成 1,4 - 环二烯。但这种反应条件苛刻，既不环保又难以持续。为此，科研人员一直在探索更温和、绿色的替代方法。

厌氧细菌中的苯甲酰辅酶 A 还原酶（BCRs）进入了科学家的视野。BCRs 在厌氧环境中降解芳香化合物的过程里发挥着关键作用，能将底物还原为环己 - 1,5 - 二烯 - 1 - 羰基辅酶 A（dienoyl-CoA），这是一种与传统桦木还原不同的邻位二氢加成产物。而且，其反应的标准氧化还原电位在生物氧化还原窗口之外，这一特性让它成为研究热点。自然界中存在两类非同源的 BCRs，它们的亚基组成和能量耦合策略各有差异。但此前，人们对 I 类 BCRs 的催化机制了解十分有限。

为了填补这一知识空白，来自德国弗莱堡大学、西班牙马德里 Margarita Salas 生物研究中心等多个机构的研究人员携手开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为该领域带来了新的突破。

研究人员采用了多种技术方法来揭开 I 类 BCRs 催化机制的神秘面纱。在蛋白质研究方面，通过异源表达技术，在大肠杆菌 MC4100 中生产了来自 Aromatoleum sp. CIB 的活性位点组件 BzdNO，并对其进行了纯化和生化表征。结构解析上，利用 X 射线晶体学技术，测定了 BzdNO 与底物苯甲酰辅酶 A（BzCoA）和产物 dienoyl-CoA 结合时的晶体结构，分辨率高达 1.4 ?。光谱分析中，运用紫外 - 可见光谱（UV-vis）和电子顺磁共振光谱（EPR）技术，研究 FeS 簇的氧化还原性质。此外，还借助量子力学 / 分子力学（QM/MM）计算，从理论层面探究反应机制。

下面来看看具体的研究结果：

• BzdNO 的富集和生化性质：研究人员选择 BzdNO 作为研究对象，它与其他四聚体 I 类 BCRs 的催化亚基序列同一性不高。在大肠杆菌中厌氧生产并纯化后，发现其铁含量比预期的两个 [4Fe-4S] 簇要高，分子量测定显示为异源二聚体结构。而且，该酶在实验条件下不表现出 BzCoA 还原酶活性，反而催化 dienoyl-CoA 的逆向重芳构化反应。
• BzdNO 的整体 X 射线结构：BzdNO 由 BzdN 和 BzdO 两个结构相似的亚基组成。它与 2 - 羟基异己酰辅酶 A 脱水酶（HAD）和含双立方烷簇蛋白（DCCP）结构相近。每个亚基都可分为三个结构域，这些结构域在稳定蛋白和构建活性位点通道方面发挥着重要作用。
• 两种不寻常类型 FeS 簇的结合：BzdN 携带一种此前仅在 DCCP 中报道过的 [8Fe-9S] 簇，其功能尚不明确。BzdO 则含有一个 [4Fe-4S] 簇，该簇的一个配体可能是水分子或羟基，且其周围环境的酸碱催化剂处于非带电状态最为合适。
• 非共价底物 / 产物结合：BzCoA 以特定方式结合在 BzdO 的活性位点通道内，其苯甲酰环与 [4Fe-4S] 簇的相对位置特殊，周围形成了疏水的微环境。产物 dienoyl-CoA 与 BzdNO 的结合模式和底物相同，而且底物结合会引起酶结构的诱导契合变化。
• FeS 辅因子的光谱特征：UV-vis 光谱和 EPR 光谱研究表明，[4Fe-4S]-OH₂和双立方烷簇可被还原，且还原过程涉及多个电子转移步骤。不同还原剂的滴定实验显示出不同的光谱变化，这与它们的氧化还原电位差异有关。
• 基于结构的 QM/MM 计算：QM/MM 计算结果支持一种涉及氢原子转移步骤的自由基机制。氢原子从 [4Fe-4S] 簇配位的水分子转移到苯环的 C4 上，生成半醌自由基中间体，随后的电子转移步骤有两种可能的反应途径。

在讨论部分，研究人员指出，不同类型的 BCRs 在厌氧环境中降解芳香化合物时，采用了不同的策略来降低氧化还原电位和稳定自由基反应中间体。I 类 BCRs 与 ATP 水解相耦合，而 II 类 BCRs 则通过黄素基电子分叉机制。尽管存在这些差异，两类 BCRs 在催化机制上却有着惊人的相似之处，都是通过金属 - OH₂辅因子向苯环转移氢原子来启动反应。

此外，对 BCR I/HAD 家族成员的结构和功能分析，揭示了它们可能的进化关系。从携带双立方烷簇的 DCCP，到含有 [8Fe-9S] 簇和 [4Fe-4S] 簇的 BzdNO，再到 HAD 和 4 - 硫尿苷 - 5'- 单磷酸脱硫酶 TudS，家族成员通过消除 FeS 亚簇，创造了新的催化功能。

这项研究意义重大，不仅为理解 I 类 BCRs 的催化机制提供了详细的分子层面信息，还为设计和开发仿生系统用于替代桦木还原过程提供了理论基础。虽然目前酶促桦木还原还局限于 CoA 酯底物，但研究人员未来有望开发出不依赖 CoA 的底物激活策略，推动该领域的进一步发展。