DNA 折纸助力侧向流动免疫分析信号放大：提升检测灵敏度的创新策略

为解决侧向流动免疫分析（LFIAs）灵敏度低的问题，研究人员开展了基于 DNA 折纸的 LFIAs 信号放大技术研究。结果显示，该技术可使检测灵敏度提升 55 - 125 倍，且兼容性强。这为提高 LFIAs 检测性能、拓展应用范围提供了新途径。

　　在现代医学检测领域，快速、准确地检测生物标志物对疾病的诊断和治疗至关重要。侧向流动免疫分析（Lateral Flow Immunoassays，LFIAs）凭借其操作简便、可快速出结果等优势，成为全球广泛应用的诊断测试方法之一，在医疗现场检测（Point-of-Care，PoC）中发挥着重要作用。然而，LFIAs 的灵敏度却不尽人意，其检测限通常在微摩尔到 10 - 100 皮摩尔浓度范围内 ，与标准实验室免疫分析（如酶联免疫吸附测定 ELISA、电化学发光 ECL 等）可达的飞摩尔到皮摩尔检测限相比，差距明显。这就导致在许多关键的现场检测场景中，LFIAs 的初始检测结果往往需要借助复杂且耗时的实验室检测进行确认，大大限制了其应用价值。因此，如何提升 LFIAs 的检测灵敏度，成为了亟待解决的问题。

在这样的背景下，来自德国路德维希 - 马克西米利安大学（Ludwig-Maximilians-Universit?t München）物理学院和纳米科学中心（Center for NanoScience，CeNS）的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦于 DNA 折纸（DNA origami）技术，试图借助这一前沿技术为 LFIAs 的灵敏度提升带来突破。研究结果表明，通过构建基于 DNA 折纸的信号放大平台，成功实现了 LFIAs 检测灵敏度的显著提升，这一成果发表在《Nature Communications》上，为免疫分析领域带来了新的希望。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是 DNA 折纸技术，通过精心设计，构建出具有特定结构和功能的六螺旋束（6HB）结构。利用该结构两端的结合域连接检测抗体，中间的信号放大域结合信号生成标签。其次，采用了凝胶电泳技术，包括琼脂糖凝胶电泳（AGE），用于对 6HBs、抗体 - 6HB 结合物以及标签 - 6HB 复合物进行表征和纯化。此外，还运用了透射电子显微镜（TEM）技术，直观观察抗体和标签在 6HBs 上的结合情况 。

DNA 折纸信号放大结构

研究人员构建的 DNA 折纸信号放大结构，其核心是一个常见的 6HB 设计。该结构由六个平行且相互连接的 DNA 双链组成，在溶液中长度为 490nm，直径 8nm 。其两端的结合域各有 3 个单链 DNA（ssDNA）短链悬突，用于连接检测抗体；中间的信号放大域含有 180 个 ssDNA 悬突，可结合 DNA 共轭标签。以检测心肌肌钙蛋白 I（cTnI）为例，研究人员先将单克隆抗 cTnI IgG 抗体通过 DNA 杂交连接到 6HB 的结合域，形成 Ab - 6HB 结合物。同时，选用了两种不同的标签，即 DNA 功能化的 40nm 金纳米颗粒（gold - DNA）和 Alexa Fluor 647 标记的 DNA 寡核苷酸（A647 - DNA）。通过透射电镜（TEM）和琼脂糖凝胶电泳（AGE）等技术，验证了抗体和标签成功结合到 6HBs 上，为后续的信号放大奠定了基础。

控制放大倍数

为了验证 DNA 折纸能否精确控制侧向流动测试中的信号放大倍数，研究人员以生物素化的 DNA 寡核苷酸为模型分析物，使用带有 A647 - DNA 标签的 6HBs 进行检测。实验中，通过调整 6HB 与 A647 - DNA 标签的摩尔比（n = 50、100 或 200）来改变放大倍数。结果显示，直接标记（n = 1）时，只能检测到 6.25nmol/L 及以上浓度的生物素 - DNA；而当 n = 200 时，检测限可低至 50pmol/L，灵敏度提高了 125 倍 。这表明 6HBs 能够有效增加测试线上的荧光团数量，实现对检测信号的放大和精确控制。并且，该信号放大系统在水、人血清和人唾液等复杂样本基质中均能稳定工作，验证了其良好的兼容性。

心肌肌钙蛋白 I 的检测

研究人员构建了基于抗体夹心的 LFIAs 用于检测 cTnI。实验使用生物素化的捕获抗体（Ab_capture-biotin）和检测抗体 - 6HB 结合物（Ab - 6HB 或 Ab₂-6HB），在同一侧向流动测试条上进行检测，测试线为链霉亲和素。在 A647 荧光检测实验中，直接标记时 cTnI 的最小检测浓度为 1.25nmol/L；使用 Ab₁-6HB 且 n = 100 时，检测限可降至 10pmol/L，检测灵敏度提高了约 100 倍，检测动态范围也增加了约 3 个数量级 。在使用 gold - DNA 标签的实验中，与传统的 Ab₂-gold 标签相比，将 Ab₂与 6HB 结合（Ab₂?6HB）后，cTnI 的视觉检测限（visual LoD）从 50pmol/L 降至 10pmol/L；进一步优化抗体夹心结构，使用 Ab₁-6HB 时，视觉检测限可低至 2pmol/L 。最终，在 15 分钟内，使用 gold - DNA 标签的检测限可达 1.5 ± 0.5pmol/L（35 ± 12ng/L），满足了快速、灵敏、简便的现场检测需求。

在研究结论与讨论部分，该研究成果意义重大。从技术层面来看，DNA 折纸技术为 LFIAs 信号放大提供了一种通用策略。其独特优势在于能够精确控制有机分子和无机颗粒的排列数量，可独立调整抗体与标签的比例，实现对检测灵敏度的灵活调节。同时，DNA 折纸结构的精确性和均一性，使其在纳米纤维素膜中具有高扩散性，有助于提高检测灵敏度。从经济成本角度考虑，每个 LFIAs 测试中 DNA 折纸的材料成本增加不到 1 美分，并且由于减少了检测抗体的使用量，有望降低整体检测成本。此外，该方法可通过选择不同的抗体，轻松适配其他生物标志物的检测，如研究中对神经丝轻链（NfL）的检测也取得了良好效果，还可在多重检测中同时使用多种标签，具有广阔的应用前景。总之，这项研究将 DNA 折纸技术成功应用于 LFIAs，为开发更高效、灵敏的诊断工具迈出了重要一步，有望推动免疫分析技术在临床诊断、现场检测等领域的进一步发展。