利用天然聚糖氧化释放后可逆标记实现克级规模天然 N - 聚糖制备：开启糖科学功能探索新征程

为解决天然聚糖功能分析受限于其低丰度、结构异质性及缺乏高效制备分离方法的问题，研究人员开展了利用家用漂白剂氧化释放天然聚糖（ORNG）、创新可裂解标签化学和优化多维色谱实现克级规模复杂天然 N - 聚糖制备的研究。结果成功制备出多种聚糖，该成果为 N - 聚糖功能探索开辟了新途径。

　　在生物医学研究的广阔领域中，糖科学作为探索聚糖（复杂碳水化合物）及其结合物生物作用的前沿阵地，正以前所未有的速度蓬勃发展。聚糖广泛分布于细胞表面和细胞外基质，在细胞通讯、免疫反应以及疾病进程中扮演着至关重要的角色，对蛋白质的折叠、稳定和运输也有着不可或缺的影响。比如，细胞之间的识别、病原体与宿主的相互作用，常常依赖于特定的蛋白质 - 聚糖相互作用。而且，异常的糖基化模式与癌症、炎症、传染病等多种疾病紧密相连。因此，深入探究聚糖的结构与功能，无疑为开发新型诊断方法和靶向疗法带来了新的希望。

然而，糖科学的发展并非一帆风顺。与基因组学和蛋白质组学相比，糖科学的研究面临着诸多挑战。聚糖复杂的结构以及研究过程中涉及的技术难题，使得其研究进展相对缓慢。其中，一个关键的限制因素是难以获取具有足够结构多样性且数量充足的生物相关聚糖，以满足功能分析的需求。传统的化学酶法虽能实现聚糖的合成，但即便经过不断改进，合成复杂聚糖仍面临技术要求高、耗时久的问题。从天然来源中分离聚糖，通常也只是小规模进行，难以获得大量用于深入功能研究的样本。

为了突破这些困境，来自美国埃默里大学医学院（Emory University School of Medicine）的研究人员积极开展研究。他们致力于开发一种通用且高效的方法，实现克级规模天然 N _- 聚糖的制备。最终，研究人员成功建立了一种利用家用漂白剂氧化释放天然聚糖（ORNG），结合创新的可裂解标签化学和优化的多维色谱技术的方法，实现了克级规模复杂天然 N _- 聚糖的制备。该研究成果发表在《Communications Chemistry》上，为糖科学领域的发展注入了新的活力。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是氧化释放天然聚糖（ORNG）技术，利用家用漂白剂从大量天然材料中提取聚糖；其次是使用 4 - 氨基苯甲酸衍生物作为可裂解标签，对聚糖进行标记，便于后续的分离和检测；然后通过干柱亲水作用液相色谱（flash - HILIC）和反相高效液相色谱（C₁₈ - HPLC）对标记后的聚糖进行分离纯化；最后运用核磁共振光谱（NMR）对纯化后的聚糖进行结构表征。

研究结果主要包含以下几个方面：

• Oxone 介导的游离还原 N _- 聚糖再生：研究人员发现，以 4 - 氨基苯甲酸衍生物（如 PABA、EPAB 和 DEAB）为标签标记聚糖后，经 Oxone 处理，能高效地将聚糖共轭物转化为游离还原 N _- 聚糖，且未观察到明显的脱唾液酸或过度氧化副产物。其中，EPAB 标签因具有适宜的疏水性，更有利于从复杂混合物中分离标记聚糖，为大规模制备提供了便利。
• 干柱亲水作用液相色谱（flash - HILIC）分离高甘露糖聚糖：研究人员以富含高甘露糖 N _- 聚糖的利马豆为原料，经 ORNG 处理、脱盐、EPAB 标记和 C₁₈固相萃取（SPE）纯化后，采用 flash - HILIC 对 EPAB 标记的利马豆 N _- 聚糖进行分离。结果显示，该方法能基于大小对高甘露糖 N _- 聚糖 - EPABs 实现近乎基线分离，从 Man₅到 Man₉均能有效分离，证明了该方法在大规模分离高甘露糖聚糖方面的有效性和实用性。
• 反相 C₁₈ - HPLC 分离高甘露糖 N _- 聚糖异构体：由于 HILIC 难以有效分离具有异构结构的聚糖，研究人员采用反相 C₁₈ - HPLC 对高甘露糖 N _- 聚糖异构体进行进一步分离。对利马豆 N _- 聚糖 EPAB 共轭物的五个 flash - HILIC 馏分进行 C₁₈ - HPLC 纯化后，得到 16 个二维（2D）馏分，每个馏分经 LC - MS 和 NMR 分析均为单一成分，成功分离出多种高甘露糖聚糖异构体。
• 利马豆聚糖的结构解析：借助分离过程中获得的大量材料，研究人员运用常规 NMR 光谱对利马豆聚糖进行结构表征。通过对糖基化位点、糖残基连接方式等结构信息的分析，鉴定出多种罕见的高甘露糖结构，如 M5 - F2、M5 - F4、M6 - F2 和 M7 - F4 等，为深入了解聚糖结构提供了重要依据。
• 蛋清粉中 N _- 聚糖的制备与结构表征：研究人员将该方法应用于蛋清粉，蛋清粉含有比利马豆更为复杂的 N _- 聚糖组。经一系列处理后，对蛋清粉来源的聚糖 - EPAB 共轭物进行两轮 flash - HILIC 分离和 C₁₈ - HPLC 纯化，得到 73 个二维（2D）馏分，多数馏分纯度大于 90%。通过 NMR 和 MS 分析，鉴定出多个复杂聚糖异构体的结构，进一步展示了该方法在处理复杂聚糖样本方面的能力。
• 喷雾干燥猪血浆粉中复杂型 N _- 聚糖的制备：喷雾干燥猪血浆（SDPP）是多种 N _- 聚糖的丰富来源，尤其是复杂型唾液酸化 N _- 聚糖。研究人员对 SDPP 进行 ORNG 处理、脱盐、C₁₈纯化和 EPAB 标记后，利用 DEAE A - 25 柱将 EPAB 共轭的 SDPP N _- 聚糖分离为中性和多种带电馏分，再通过制备型 C₁₈ - HPLC 对目标馏分进行分离，成功实现了克级规模的二唾液酸化、核心 6 - 岩藻糖基化双天线聚糖（S2G2F）和多毫克级的三唾液酸化、核心岩藻糖基化 N _- 聚糖的制备，并对其结构进行了全面表征。

研究结论和讨论部分表明，该研究成功开发了一种通用且高效的方法，利用 4 - 氨基苯甲酸衍生物作为定量可逆标签，实现了从毫克级到克级规模复杂天然 N _- 聚糖库的制备。该方法有效解决了天然聚糖分离过程中面临的诸多挑战，如低丰度、异质性、纯度限制和复杂结构表征等问题。通过这种 “反向” 合成策略，以糖蛋白混合物为起始材料，不仅获得了大量难以通过现有合成方法制备的复杂聚糖，还为进一步拓展生物医学相关聚糖和糖结合物的化学空间奠定了基础。同时，研究人员预期，随着聚糖收集量的增加和 NMR 数据的积累，利用 NMR 进行聚糖结构分析将变得更加简便，甚至可能借助人工智能实现自动化。这一研究成果为糖科学领域的功能研究提供了丰富的资源和有力的工具，有望推动相关疾病的诊断、治疗以及生物医学的发展。