Paclobutrazol 诱导桑黄孔菌三萜生物合成的关键机制揭示：转录因子 SlMYB 的负调控作用

《Communications Biology》：Paclobutrazol induces triterpenoid biosynthesis via downregulation of the negative transcriptional regulator SlMYB in Sanghuangporus lonicericola

为解决桑黄孔菌三萜类化合物野生资源短缺、其生物合成调控机制不明的问题，研究人员开展了关于 Paclobutrazol（PBZ）对桑黄孔菌（Sanghuangporus lonicericola）三萜生物合成诱导作用及机制的研究。结果发现 PBZ 能显著提高三萜产量，SlMYB 起负调控作用。该研究为提升三萜合成提供策略。

　　在大自然的生物宝库中，真菌类生物一直扮演着独特且重要的角色。桑黄孔菌作为一类具有药用和食用价值的大型真菌，其中的三萜类化合物是其发挥药用功能的关键成分，比如具有抗氧化、抗菌以及抗肿瘤等活性。然而，野生桑黄孔菌资源稀缺，如何提高三萜类化合物的生物合成效率成为研究热点。此前，虽有研究利用化学诱导剂提升桑黄孔菌属中次生代谢产物的产量，但对于三萜生物合成的上游调控机制，尤其是转录因子的作用，仍知之甚少。

为了深入探究这些问题，中南林业科技大学的研究人员开展了一系列研究。他们聚焦于 Paclobutrazol（PBZ）对桑黄孔菌三萜生物合成的影响，相关研究成果发表在《Communications Biology》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。通过广泛靶向代谢组学技术，分析 PBZ 诱导下桑黄孔菌代谢物水平的差异；利用转录组测序（RNA-seq）分析 mRNA 水平的变化；构建 RNA 干扰（RNAi）和过表达质粒及菌株，探究基因功能；运用电泳迁移率变动分析（EMSA）验证蛋白与 DNA 的相互作用 。

研究结果如下：

• PGRs 对三萜合成和菌丝生长的影响：研究人员在发酵培养基中添加不同浓度的植物生长调节剂（PGRs），包括 PBZ、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）和 6 - 苄氨基嘌呤（6 - BA），研究其对桑黄孔菌三萜产量和菌丝生长的影响。结果显示，PBZ 和 IAA 能显著提高三萜产量，其中 100mg/L PBZ 诱导时三萜产量最高，达 42.341±0.442mg/g，比对照（CK）提高了 151.39% 。不过，高浓度（100mg/L）的 PBZ 会抑制菌丝生长，而 NAA 和 6 - BA 对三萜产量无显著影响。综合考虑，100mg/L 的 PBZ 被选为后续研究的最佳诱导剂。
• PBZ 诱导下的广泛靶向代谢组学分析：对 PBZ 诱导和未诱导条件下培养 2 天和 4 天的发酵菌丝进行广泛靶向代谢组学分析。共检测到 801 种代谢物，其中 29 种为三萜类化合物。在 PBZ 诱导下，25 种三萜类化合物丰度增加，18 种为新产生的三萜类化合物。这些结果表明 PBZ 诱导显著增加了桑黄孔菌三萜类化合物的多样性和产量。
• PBZ 诱导下的转录组分析：基于 RNA - seq 分析 PBZ 诱导下桑黄孔菌的基因表达谱。在 CK2 与 PBZ2、CK4 与 PBZ4 的比较组中，分别鉴定出 4424 个和 7462 个差异表达基因（DEGs）。GO 富集分析和 KEGG 富集分析表明，DEGs 主要富集在萜类生物合成、乙酰辅酶 A 代谢等相关通路，且三萜类化合物通过甲羟戊酸途径（MVA）合成。
• 响应 PBZ 诱导且潜在负调控三萜生物合成的 MYB 转录因子的鉴定：通过同源比对和系统发育分析，鉴定出一个 MYB 转录因子 SlMYB。其表达水平随 PBZ 诱导时间增加而降低，且与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中的两个基因显著相关，表明其表达可能受 MAPK 信号通路调控。此外，SlMYB 与大多数三萜生物合成结构基因呈负相关，推测其可能是三萜生物合成的负调控因子。
• RNAi 介导的 SlMYB 抑制和过表达对桑黄孔菌三萜生物合成基因表达和三萜积累的影响：构建 SlMYB 的沉默和过表达载体并转化桑黄孔菌。沉默 SlMYB 后，三萜生物合成相关基因（如 ACAT、MVD、IDI 和 FDPS）的表达水平显著增加，三萜产量和羊毛甾醇含量也显著提高；而过表达 SlMYB 则抑制这些基因的表达，降低三萜产量和羊毛甾醇含量。这表明 SlMYB 受 PBZ 处理下调，负调控 ACAT、MVD、IDI 和 FDPS 的表达，促进三萜生物合成。
• SlMYB 直接结合 MVD、IDI 和 FDPS 的启动子：MVD、IDI 和 FDPS 是三萜生物合成的关键基因。在其启动子区域存在潜在的 MYB 结合位点（MBS）。EMSA 实验证实，SlMYB 能直接结合这些基因的启动子，且呈浓度依赖性，表明 SlMYB 通过直接负调控 MVD、IDI 和 FDPS 的转录，在三萜积累中发挥重要作用。

在讨论部分，研究人员指出，该研究首次将 PBZ 应用于促进真菌中三萜类化合物的合成，并阐明了 MYB 转录因子 SlMYB 在 PBZ 诱导三萜生物合成中的负调控作用。虽然高浓度 PBZ 抑制桑黄孔菌菌丝生长，但它在增强三萜生物合成方面效果显著。新产生的三萜类化合物具有多种药理活性，为开发新型药物提供了潜在资源。此外，研究还发现 PBZ 诱导可能通过影响 MAPK 信号通路，磷酸化 SlMYB 蛋白，进而下调其表达。

综上所述，该研究提出了 PBZ 诱导桑黄孔菌三萜生物合成的更全面机制，为提高桑黄孔菌属中三萜类化合物的合成提供了有效发酵策略，也为研究真菌中 MYB 转录因子在三萜合成中的调控机制指明了方向。不过，PBZ 影响 SlMYB 转录因子的详细潜在机制仍有待进一步研究，未来还需开发已鉴定的 CYPs 转基因株系，以明确其在桑黄孔菌三萜生物合成途径中的作用。