综述：肌萎缩侧索硬化症：聚焦细胞质运输和蛋白质稳态

《Molecular Neurobiology》：Amyotrophic Lateral Sclerosis: Focus on Cytoplasmic Trafficking and Proteostasis

这篇综述聚焦肌萎缩侧索硬化症（ALS），探讨了其发病机制中内质网应激、囊泡运输和轴突运输等关键过程。研究发现，相关基因突变导致蛋白质聚集，进而影响细胞内运输和蛋白质稳态，与多种细胞功能障碍相关。对这些机制的深入理解有助于开发新的治疗方法。

　　

引言

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS），也叫卢伽雷氏病，是一种成年起病、进行性且致命的神经肌肉疾病，其特征为脑干和脊髓的上下运动神经元（MNs）发生退化。该病平均发病年龄在 55 - 60 岁，初期症状表现为肌肉无力和运动协调困难，随后会出现言语、吞咽障碍，呼吸麻痹，通常在症状出现后的 2 - 5 年内死亡 。ALS 是成人中最常见的运动神经元疾病，每 10 万人中约有 5 例。其中，约 10% 的 ALS 病例是由孟德尔或非孟德尔遗传模式导致的，被称为家族性 ALS（fALS）；而其余约 90% 的病例则由环境因素和遗传易感性共同作用引起，称为散发性 ALS（sALS） 。尽管病因不同，但 fALS 和 sALS 患者的症状和神经病理特征并无明显差异。

目前已确定 50 多个基因与 fALS 的发生或疾病进展相关，其中最常见且研究较多的致病基因包括编码超氧化物歧化酶 1（SOD1）、TAR DNA 结合蛋白 43（TARDBP）、融合肉瘤蛋白（FUS）和 9 号染色体开放阅读框 72（C9orf72）的基因 。C9orf72 基因突变是 fALS 最常见的病因，约占所有病例的 50% 。SOD1 是一种铜 / 锌结合超氧化物歧化酶，可清除超氧化物；TDP43 和 FUS 是 RNA 结合蛋白；C9orf72 则是一种多功能蛋白，在囊泡运输和自噬调节中发挥作用。研究发现，这些基因的突变通过功能获得或功能丧失机制引发疾病。例如，C9orf72 基因突变是由于基因第一内含子中六核苷酸（GGG_GCC）重复扩增（HRE），转录后经非经典的重复相关非 AUG（RAN）翻译产生五种不同的二肽重复（DPR）蛋白，这些蛋白会在细胞质中聚集形成有毒的内含物 。同时，未完全转录的 RNA 会形成复杂的二级结构，与捕获的蛋白质一起积聚在核内形成 RNA 病灶，影响核功能。

sALS 的发病被认为是环境因素和遗传易感性共同作用的结果。相关环境因素包括接触农业农药、重金属、溶剂、电磁场、环境变暖、吸烟和体力消耗等 。近年来，微生物组改变和病毒也被认为与 ALS 的发生有关 。此外，大量基因的突变或多态性被发现会增加患 ALS 的易感性。

目前，ALS 尚无有效的治疗方法。研究人员利用多种实验模型，如原代神经元、细胞系模型以及线虫、果蝇、斑马鱼和啮齿动物等体内模型，来探究 ALS 的细胞和分子机制。研究发现，错误折叠蛋白的积累和聚集是 ALS 发病机制中研究最多的方面，此外还涉及 RNA 加工失调、线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性毒性、核质和囊泡运输异常、高尔基体碎片化、轴突运输缺陷、细胞质应激颗粒以及其他核质内含物的形成和神经炎症等细胞异常 。值得注意的是，这些细胞缺陷并非 ALS 所特有，在多种其他神经退行性疾病中也有出现。虽然目前尚不清楚这些异常中哪些是导致 MN 退化的起始事件，但异常蛋白质聚集与大多数功能失调过程密切相关。

ER 应激受损

在细胞内，膜蛋白、大多数细胞器和细胞区室的驻留蛋白以及分泌蛋白都是在粗面内质网（ER）的壁上合成，并通过 Sec61 转运体插入 ER 。新生蛋白质在进入 ER 后，会在分子伴侣和多种酶的作用下进行折叠和修饰，以获得功能。正确折叠的膜蛋白和可溶性蛋白会被包装在由多亚基 COP-II 蛋白包被的囊泡中，从光滑的 ER 膜上出芽。这个过程由小 GTP 酶 Sar1（分泌相关 RAS 相关 1）及其鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）Sec12 启动，Sar1 被激活后，COP-II 包被的囊泡从 ER 膜出芽，随后运输到内质网 - 高尔基体中间区室（ERGIC），并与 cis - 高尔基体融合，在那里蛋白质会进一步被修饰、分类，然后通过囊泡运输到目的地。

然而，大量新合成进入 ER 的蛋白质无法正确折叠。ER 中的分子伴侣会尝试重新折叠它们，如果失败，这些错误折叠的蛋白质会通过一种称为 ER 相关降解（ERAD）的过程被运输出 ER，泛素化后由细胞质蛋白酶体降解。此外，错误折叠或聚集的蛋白质还可以通过自噬在溶酶体中降解。当错误折叠的蛋白质在 ER 中持续积累，无法被 ERAD 或自噬清除时，就会导致 “ER 应激”，进而触发细胞内特定信号通路的激活，这些通路统称为未折叠蛋白反应（UPR） 。UPR 通过多种方式缓解 ER 应激，如扩展 ER 膜以增加腔室空间、抑制新蛋白质合成以减少进一步的应激、增加 ER 中分子伴侣的表达以重新折叠错误折叠的蛋白质，以及上调 ERAD 机制以增强对错误折叠蛋白质的清除 。如果 UPR 无法缓解 ER 应激，细胞就会激活促凋亡基因，导致细胞死亡。UPR 主要由三条信号通路组成，分别通过三种不同的蛋白质激活：肌醇需求蛋白 - 1α（IRE1α）、蛋白激酶 RNA（PKR）样 ER 激酶（PERK）和激活转录因子 6（ATF6） 。在 ER 未受到应激时，这些 UPR 起始蛋白会与 BiP（结合免疫球蛋白蛋白，也称为 GRP - 78）结合而保持失活状态。当 ER 受到应激时，BiP 会释放 IRE1α、PERK 和 ATF6，使它们能够发出信号。

IRE1α 信号通路的激活会导致 X 盒结合蛋白 1（XBP1）mRNA 的剪接，产生 sXBP1 mRNA，其编码的转录因子 XBP1s 会刺激编码分子伴侣的基因表达，并增加 ERAD 活性 。IRE1α 的激活也可能导致过度的内切核糖核酸酶活性，从而在 ER 膜上引起 mRNA 降解，减少蛋白质翻译，这一机制被称为调节性 IRE1 依赖性衰变（RIDD） 。PERK 通路通过磷酸化 eIF2α（eIF2 复合物的一个组成部分）来抑制 eF2 的活性，从而减少蛋白质合成。虽然 PERK / 磷酸化 - eF2α 介导的翻译抑制会抑制全局翻译，但一些 mRNA 可以通过使用上游开放阅读框（uORFs）或内部核糖体进入位点（IRES）逃避抑制，其中包括编码激活转录因子 4（ATF4）和 ATF5 的 mRNA，它们在 ER 应激期间发挥作用，刺激其他对 PERK 翻译抑制具有抗性的基因转录，这些基因参与减少应激、重新启动全局帽依赖性翻译或诱导凋亡 。ATF6 会转移到高尔基体，在那里被切割，释放出其胞质部分，作为转录因子激活分子伴侣基因和脂质生物合成 。

除了作为 UPR 的一部分，PERK 还是更广泛的细胞应激反应 —— 整合应激反应（ISR）的一部分。ISR 由另外三种激酶组成，它们共同作用以恢复细胞内稳态或促进细胞死亡 。这三种激酶包括被病毒感染激活的蛋白激酶 R（PKR）、被缺氧激活的血红素调节 eIF2α 激酶（HRI）和被氨基酸剥夺激活的一般控制非阻遏 2 激酶（GCN2）。尽管这四种 ISR 激酶由不同的稳态失调信号触发，但它们激活的通路都会通过磷酸化 eIF2α 抑制全局翻译 。此外，ER 应激还可以通过 ER 特异性自噬受体来缓解，这些受体可以促进错误折叠蛋白质的溶酶体降解，或者在 ER 功能失调时激活 ER 自噬（ERphagy）。ERphagy 是一种选择性的宏观自噬，它专门将功能失调的 ER 包装到自噬体中，以便进行溶酶体降解 。未解决的 ER 应激会影响其他细胞器，例如线粒体。ER 和线粒体通过称为线粒体 - 内质网（ER）接触（MERCs）的多蛋白结构直接接触，这种接触在 ER 的钙稳态管理中起着重要作用。ER 中钙的消耗会导致蛋白质聚集、ER 应激以及由过度 ER 应激引发的凋亡 。此外，MERCs 的损伤会影响线粒体的多种活动，包括钙稳态的维持、脂质交换、代谢变化的检测、线粒体分裂和线粒体自噬 。

在 ALS 的动物模型以及患者的大脑和脊髓中，蛋白质聚集体的持续存在表明，蛋白质折叠机制的功能障碍和 / 或蛋白质清除机制的缺陷与疾病的发病机制有关 。在负责 ER 中新生蛋白质正确折叠的众多蛋白质中，有一个由二十多种蛋白质二硫键异构酶（PDIs）组成的家族，它们同时具有分子伴侣和氧化还原酶的活性 。在突变 SOD1 - ALS 的转基因小鼠模型中，过表达 ERp57（PDI 家族的一员，也称为 PDIA3）具有保护作用，可抑制突变 TDP - 43 在 MN 样细胞系中的错误定位、聚集和毒性作用 。有趣的是，PDI 和 ERp57 的错义突变和内含子变异与运动功能障碍和 ALS 有关 。与其他定位于 ER 并与 ER 膜相关的 PDI 蛋白不同，ERp57 不仅定位于 ER 腔，还存在于其他亚细胞区室，包括细胞质、线粒体和细胞核，在这些地方它可能具有其他功能 。目前尚不清楚其在非 ER 区室中的功能受损在多大程度上导致了 ALS 的发病机制。在线粒体中，ERp57 可调节钙摄取，而 ALS 患者 MNs 中线粒体钙稳态的功能障碍已有充分记录 。

ALS 患者细胞质中积累的蛋白质内含物呈泛素阳性，这进一步表明蛋白酶体无法降解这些蛋白质。事实上，一些基因的变异会导致或促成 ALS，这些基因参与蛋白酶体或自噬性蛋白质降解，包括 C9orf72、Optineurin（OPTN）、Valosin - Containing Protein（VCP）、vesicle - associated membrane protein B（VAPB）、TANK binding kinase（TBK1）和 UBQLN2 等 。虽然 C9orf72 突变可以通过功能获得的方式促进 MN 退化，但它也是蛋白质自噬降解的关键调节因子，在多个层面发挥作用。C9orf72 功能丧失或单倍体不足会导致与自噬相关的多种缺陷，包括溶酶体功能障碍、自噬通量减少以及自噬受体 p62 在聚集体中的积累 。然而，最近一项使用来自 C9orf72 ALS 患者的诱导多能干细胞（iPSC）衍生的 MNs 进行的研究发现，这些过程的变化并不显著，这表明需要进一步分析来解决这些问题 。UBQLN2 是一种与 ER 外膜上的其他蛋白质相互作用的蛋白，它介导 ER - 高尔基体囊泡运输以及泛素化蛋白质向蛋白酶体的运输以进行降解。ALS 相关的 UBQLN2 突变会损害 ERAD 和 ER - 高尔基体运输，导致 ERGIC 和高尔基体碎片化，进而引发 ER 应激 。VCP，也称为 p97，是一种广泛表达的 AAA + ATP 酶，在蛋白酶体降解和自噬过程中都起着重要作用，这些过程通过多蛋白复合物的组装来介导 。在 ERAD 机制中，VCP 负责展开泛素化蛋白质，使其能够进入蛋白酶体进行降解；在自噬机制中，VCP 参与一种称为溶酶体自噬（lysophagy）的过程，用于降解受损的溶酶体，缺乏 VCP 会导致自噬功能失调 。ALS 相关的 VCP 突变会损害其这两种降解功能 。VAPB 基因的单个突变在世界某些地理区域是 fALS 的罕见病因，但在其他地区则不是 。VAPB 和 VCP 都是 MERCs 的一部分，它们将线粒体与 ER 连接起来 。表达 ALS 相关的突变 VAPB 会导致 MERC 功能障碍，破坏 ER 和线粒体之间的钙运输，这是 ALS 中一种已被充分描述的病理改变 。突变 VAPB 诱导的钙稳态失调会导致线粒体和 ER 功能障碍 。OPTN 是一种自噬受体，通过直接结合参与清除细胞质蛋白质聚集体和功能失调的线粒体 。ALS 相关的 OPTN 突变不仅会影响蛋白质聚集体的清除，还可能在 ALS 中这些聚集体的形成中起因果作用 。TBK1 是 IKB 激酶（IKK）家族的成员，已被确定为自噬和线粒体自噬中通过 p62 和 OPTN 磷酸化发挥作用的重要货物招募调节因子。TBK1 功能受损会导致自噬失调，促进 ALS 病理生理学中的蛋白质聚集 。此外，TBK1 功能受损引起的自噬缺陷会促进神经炎症，这是一种已知的导致 ALS 和其他神经退行性疾病中神经元死亡的异常情况 。然而，一项研究发现，一种 ALS 相关的 TBK1 突变在小鼠中导致自噬功能障碍和 MN 退化，但不会促进神经炎症，这表明 TBK1 对自噬和神经炎症的调节涉及不同的信号机制 。

虽然 ALS 中的神经退行性变主要影响 MNs，但蛋白质聚集体的积累并不局限于 MNs。有证据表明，其他神经元类型能够应对这些聚集体，而 MNs 处理 ER 应激的能力较低，这可能解释了为什么它们在 ALS 中选择性地退化。支持这一观点的是，研究发现，与非运动神经元细胞相比，来自 ALS 患者 iPSCs 的运动神经元在对化学诱导的 ER 应激做出反应时更容易死亡。在 ALS 的实验模型和患者 iPSCs 衍生的运动神经元中，都有 ER 应激反应功能失调的证据 。在培养细胞中，突变 SOD1 会诱导 ER 应激，导致 IRE - 1 和 PERK 的异常激活，而野生型 SOD1 则不会 。在 SOD1 - ALS 小鼠模型中，PERK 单倍体不足会加速疾病发作并缩短寿命，这表明异常的 ISR 参与了 ALS 的发病机制 。然而，随后一项使用五种不同的突变 SOD1 - ALS 小鼠品系的研究对此提出了质疑，该研究发现，无论是 PERK 单倍体不足还是 GADD34（一种在 ISR 期间由 ATF4 诱导并刺激自噬的蛋白质）的缺乏，都无法改善神经病理学或疾病进程 。

突变 SOD1 诱导 ER 应激的选择性作用可以解释为它能够与 Derlin 相互作用并抑制其功能，Derlin 是一种 ER 膜多蛋白复合物的组成部分，负责将错误折叠的蛋白质从 ER 中输出，是 ERAD 的一部分 。除了抑制 ERAD 导致 ER 应激外，突变 SOD1 还激活凋亡信号调节激酶 1（ASK1），这是一种促凋亡蛋白，会被 UPR 激活，导致应激细胞死亡 。CHOP 是另一种促凋亡蛋白，也是 ASK1 的下游靶点，在 SOD1 - ALS 患者、散发性 ALS 患者以及 SOD1 - ALS 小鼠中，其表达均升高 。在 ALS 小鼠中，ATF3 的表达和 c - Jun 的磷酸化（两者都是凋亡介质）也会增加，并且这种增加发生在 MNs 死亡之前 。

与 PERK 类似，UPR 的 IRE1α 和 ATF6 分支也存在调节异常，并对 ALS 的病理过程有贡献 。在转基因突变 SOD1 - G93A 小鼠和 NSC34 细胞（一种 MN 样细胞系）中，eIF2α 的磷酸化以及 XBP1 和 ATF6 mRNA 和蛋白质的表达均升高 。同样，在表达突变 SOD1（而非野生型 SOD1）后，MNs 和 NSC34 MN 样细胞系中 ATF6 的表达、蛋白水解激活和核定位都会增加 。然而，最近另一项使用相同 SOD1 - ALS 小鼠模型的研究发现，突变小鼠脊髓中 ATF6 的表达并不高于野生型小鼠。此外，该研究组发现，给予瑞格列奈（一种抑制 ATF6 与神经元钙传感器 DREAM 相互作用的药物抑制剂）可以减少 SOD1 - ALS 小鼠的 MN 损失，这一作用与脊髓中 ATF6 加工的增加有关 。目前尚未评估 ATF6 加工失调在 ALS 发病机制中的作用 。

与正常 MNs 相比，SOD1^G93A小鼠的 MNs 中 IRE1α - XBP1 通路的活性升高，导致 XBP1 mRNA 剪接增加并产生 XBP1s 转录因子 。在 MN 样细胞系和有症状的 SOD1 - ALS 小鼠的脊髓（但不是小脑）中，XBP1 的剪接增加 。支持 XBP1 mRNA 在 ALS 中起致病作用的证据是，缺乏 XBP - 1 基因的 SOD1 - ALS 小鼠显示出突变 SOD1 聚集体减少，并且对发生 ALS 相关的病理衰退更具抵抗力 。这种保护作用是由于缺乏 XBP1 基因的小鼠中自噬大量增加，从而增强了对突变 SOD1 聚集体的清除 。

虽然 ISR 通常是一种保护性的细胞机制，但有证据表明，其异常激活会促进 ALS 的发病机制。升高的 ISR 会选择性地增加 C9orf72 六核苷酸重复序列的 RAN 翻译，产生有毒的 DPRs，这一改变涉及磷酸化 - eIF2α 依赖性应激颗粒的形成和全局蛋白质翻译的抑制 。化学诱导的 ISR 激活会导致来自 C9orf72 ALS 患者的 iPSCs 衍生的 MNs 中 DPRs 积累。一旦产生，DPRs 的积累本身就会刺激 ISR，形成一种正反馈的致病循环 。C9orf72 六核苷酸重复区域转录的 RNA 也可以诱导 ISR 激活，这种 RNA 会形成大量的二级结构 。PERK 在这个致病循环中起着关键作用，支持这一观点<