基于凝血酶嵌入纳米药物的实体肿瘤药代动力学调控研究

《Journal of Nanobiotechnology》：Pharmacokinetics modulation in solid tumors through thrombin-embedded nanomedicine

为解决抗肿瘤纳米药物在实体肿瘤中难以持续保留和广泛分布的问题，研究人员开展了凝血酶嵌入纳米药物对实体肿瘤药代动力学调控的研究。结果表明该纳米药物能有效抑制肿瘤生长且毒性低，为癌症治疗提供了新策略。

　　在肿瘤治疗领域，传统化疗面临诸多困境。一方面，肿瘤的异质性使得纳米药物在肿瘤组织内分布不均，难以持续保留和广泛扩散，影响治疗效果；另一方面，化疗药物的非特异性分布会带来严重的全身毒性，让患者承受巨大痛苦。为攻克这些难题，来自复旦大学、浙江大学、大连理工大学附属肿瘤医院等多机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表于《Journal of Nanobiotechnology》。

研究人员采用了多种关键技术方法。在纳米药物制备方面，通过化学合成手段将靶向基团环肽（cRGD）、聚乙二醇（PEG）、聚赖氨酸（PLys）等进行连接，并将化疗药物 7 - 乙基 - 10 - 羟基喜树碱（SN38）通过氧化还原敏感的二硫键连接到载体上，同时将凝血酶（Thrombin）进行羧化修饰后连接到纳米载体，构建出具有时空响应性的双重前药纳米药物（cRGD-pro (S&T) NPs）。利用动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）等技术对纳米药物的理化性质进行表征。在体内研究中，建立人乳腺癌 MCF-7 细胞异种移植实体瘤模型，观察纳米药物的抗肿瘤效果。运用免疫荧光染色、基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）等技术探究纳米药物在肿瘤组织内的分布、作用机制等。

纳米药物的设计与合成

研究人员设计并成功合成了具有靶向性和响应性的纳米药物。以 cRGD - PEG - PLys 为载体，通过二硫键连接 SN38 形成 cRGD - pro (S)，再将羧化修饰的凝血酶连接到该载体上得到 cRGD - pro (S&T) NPs。通过一系列化学反应和检测手段，如核磁共振光谱（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT - IR）、质谱（MS）、高效液相色谱（HPLC）等，证实了纳米药物的成功合成，且其具有良好的胶体稳定性，临界聚集浓度（CAC）约为 0.035mg/mL 。

纳米药物的理化性质

动态光散射测量显示，cRGD - pro (S) 的流体动力学直径约为 73.6nm，cRGD - pro (S&T) 约为 83.4nm，在模拟肿瘤微环境 pH 6.5 条件下，cRGD - pro (S&T) 的流体动力学直径增加到约 135.2nm ，这是由于凝血酶前药的脱羧作用导致其与载体间相互作用减弱。透射电子显微镜观察到 cRGD - pro (S&T) 呈均匀球形，粒径在 70 - 80nm 。此外，该纳米药物在磷酸盐缓冲液（PBS）中长时间孵育后，尺寸和多分散指数（PDI）保持稳定，进一步证明了其良好的稳定性。

纳米药物的响应性

通过实验证实了纳米药物的 pH 和氧化还原响应性。在 pH 6.5 的酸性条件下，cRGD - pro (S&T) 中的凝血酶前药发生脱羧反应，释放出具有生物活性的凝血酶，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，引发红细胞聚集和血栓形成，从而阻断肿瘤血管。在细胞内富含谷胱甘肽（GSH）的还原环境下，cRGD - pro (S&T) 中的二硫键断裂，释放出 SN38。体外实验显示，在 pH 7.4 且无 GSH 时，48 小时内 SN38 释放量仅为 9.1%，而在含 10mM GSH 的条件下，释放量飙升至 64.1% ，表明纳米药物能在肿瘤微环境中精准释放药物。

纳米药物的体外生物学性能

采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察发现，cRGD - pro (S) 纳米颗粒与 MCF - 7 细胞共培养后，早期 SN38 主要存在于内溶酶体中，随着时间推移逐渐分散到细胞质，并最终在细胞核中积累，发挥抑制拓扑异构酶 I 的作用。体外细胞毒性实验表明，该纳米药物对多种癌细胞系具有显著的细胞毒性，其半数抑制浓度（IC₅₀）在几十纳摩尔范围内，且相较于传统纳米封装化疗药物，其细胞毒性并未因复杂的合成和封装过程而减弱。

纳米药物的体内抗肿瘤效果

在人乳腺癌 MCF - 7 细胞异种移植实体瘤模型中，评估了纳米药物的体内抗肿瘤效果。结果显示，与对照组相比，cRGD - pro (S&T) 纳米药物显著抑制了肿瘤生长，肿瘤抑制率高达 91.9% 。同时，该纳米药物具有良好的安全性，未引起明显的全身毒性，而游离的 SN38 则导致小鼠体重下降、脾脏萎缩等明显的全身毒性。此外，纳米药物在肿瘤组织中的积累量显著高于其他主要器官，且 cRGD 修饰增强了纳米药物的肿瘤靶向性。

纳米药物的作用机制

通过免疫荧光染色和 MALDI MSI 等技术研究发现，凝血酶的释放可诱导肿瘤血管闭塞，减少肿瘤血管密度，降低肿瘤内血红蛋白含量，造成局部缺氧环境，抑制肿瘤生长。同时，血管闭塞降低了肿瘤内压力，促进了化疗药物的渗透和分布，使 SN38 在肿瘤组织内能够维持较高浓度长达 5 - 6 天，增强了化疗效果。

研究结论和讨论部分指出，本研究构建的双重前药纳米药物为三阴性乳腺癌（TNBC）治疗带来了创新突破。其通过 pH 和氧化还原响应性释放前药，实现了对药物释放的时空精准控制，有效降低了全身毒性，提高了治疗指数。凝血酶诱导的血管闭塞促进了化疗药物的均匀分布和持续释放，显著增强了化疗的细胞毒性，抑制了肿瘤生长。然而，未来研究仍需优化纳米药物的理化性质，探索联合治疗策略，进一步明确其长期安全性、有效性和药代动力学特征。该研究成果为 TNBC 及其他对传统化疗耐药的恶性肿瘤治疗提供了新的方向和希望，有望推动癌症治疗领域的重大变革，开启靶向和协同抗癌治疗的新时代。