基于亚硫酸氢盐和酶法 DNA 转化方法的比较性能评估：为精准 DNA 甲基化分析提供关键依据

《Clinical Epigenetics》：Comparative performance evaluation of bisulfite- and enzyme-based DNA conversion methods

为解决亚硫酸氢盐转化（BC）在处理低质量和低数量 DNA 样本时存在的问题，研究人员开展了 BC 和酶法转化（EC）的性能比较研究。结果表明两者各有优劣，该研究为评估 DNA 转化方法提供了重要参考，有助于推动 DNA 甲基化分析技术的发展。

　　在生命科学和健康医学领域，DNA 甲基化（DNA methylation）作为重要的表观遗传标记，与衰老、疾病等众多生物过程紧密相连。它主要发生在 CpG 二核苷酸（CpG dinucleotides，又称 CpG 位点）上，这些位点常集中于基因启动子区域，其甲基化状态对基因表达起着关键的调控作用，进而影响生物表型和疾病的发生发展 。

长期以来，亚硫酸氢盐转化（Bisulfite conversion，BC）一直是 DNA 甲基化分析的金标准方法。在这个过程中，未甲基化的胞嘧啶会被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，随后通过 DNA 测序等技术分析转化前后胞嘧啶的比例，就能确定 CpG 位点的甲基化状态 。然而，BC 存在诸多弊端。例如，它需要大量的 DNA 样本，对于珍贵的低质量样本来说，这一要求难以满足；在处理过程中，BC 会导致 DNA 片段化和损失，使得后续的下游分析受限；而且经过转化后，基因组的序列复杂性降低，这会影响引物或探针的结合特异性，从而降低检测的准确性 。

为了克服 BC 的这些缺点，一种非化学的酶法转化（Enzymatic conversion，EC）技术应运而生。EC 通过一系列酶促反应实现 DNA 甲基化的检测，它先利用 TET 氧化和 T4 - BGT 糖基化将甲基化的胞嘧啶（5mC）用羧基阻断，使其不被转化，然后通过 APOBEC 将未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为二氢尿嘧啶（DHU），在 PCR 过程中 DHU 会被替换为胸腺嘧啶，最终实现未甲基化胞嘧啶到胸腺嘧啶的转化，且避免了 BC 中使用的 harsh 化学条件 。但目前对于 EC 和 BC 的性能比较，仍缺乏系统的研究。

为了解决这一问题，来自 Erasmus MC University Medical Center Rotterdam 等机构的研究人员开展了相关研究。他们旨在通过系统评估 BC 和 EC 这两种方法的性能，为科学界提供有价值的参考，明确两种方法的优势与不足，以便在实际应用中根据样本类型和实验目的选择更合适的转化方法 。最终，该研究成果发表在《Clinical Epigenetics》杂志上。

在研究过程中，研究人员用到了几个主要关键的技术方法。首先是 qBiCo 技术，这是一种基于多重 TaqMan 的定量 PCR 方法，能够评估转化后的 DNA 样本的多个性能参数，包括基因组范围内的转化效率、转化后 DNA 浓度和片段化程度 。其次，研究使用了从健康供体获取的全血样本，从中提取基因组 DNA（gDNA）用于后续实验 。

下面来看看具体的研究结果：

• 选择 DNA 转化和 qPCR 评估方法：研究选用了 Zymo Research 的 EZ DNA methylation kit 作为 BC 的代表试剂盒，因为它在文献中备受认可，且被公司推荐用于 Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip array 这种甲基化发现研究的金标准实验；而 EC 则选用了 New England Biolabs 的 NEBNext? Enzymatic Methyl - seq Conversion Module，这是目前市场上唯一的酶法转化试剂盒 。同时，研究人员对两种方法的实验方案进行了微调，以确保公平比较，并采用 qBiCo（v2）工具来评估转化效果 。
• 评估全球转化效率：研究发现，在大多数情况下，BC 和 EC 的转化效率相似。当 DNA 输入量为 100 ng 时，BC 的转化效率为 98.5 ± 1.0%，EC 为 98.7 ± 2.1%；当输入量降低到 10 ng 时，BC 为 97.8 ± 0.7%，EC 为 97.9 ± 0.9% 。不过，当 DNA 样本经过 UV 处理后，BC 的转化效率下降更为明显，例如在 120 s UV 处理后，BC 的转化效率降至 54.3 ± 7.7%，而 EC 仍能保持在 83.9 ± 6.0% 。
• 评估转化后 DNA 回收率：BC 的转化后 DNA 回收率普遍高于 EC。在 100 ng DNA 输入量时，BC 的回收率为 2.5 ± 0.7，EC 仅为 0.7 ± 0.2 。而且，BC 的回收率在低 DNA 输入量时存在高估现象，而 EC 的回收率则较低，可能与手动进行的磁珠清理步骤有关 。
• 评估转化后 DNA 片段化：BC 导致的 DNA 片段化程度明显高于 EC。在单一实验中，BC 的片段化指数为 2.2 ± 0.4，是 EC（0.8 ± 0.1）的 2.7 倍 。并且，UV 处理和超声处理会使 BC 样本的片段化指数大幅增加，相比之下，EC 对这些处理更为稳健 。
• 基于 qBiCo 的整体 DNA 转化方法性能评估：综合考虑三个指标，研究发现 BC 和 EC 的可重复性检测限均为 10 ng 。随着片段化程度增加，转化效率会下降，在低甲基化样本中，两种方法的性能都会降低 。
• 低水平 DNA 转化（10 ng）的应用和变异性：研究人员用 10 ng 的全血样本进行实验，结果显示 BC 和 EC 的转化效率分别为 97.3 ± 1.4% 和 97.8 ± 1.0%，BC 的回收率高估，EC 的回收率低，且 BC 的片段化程度更高 。

研究结论和讨论部分指出，BC 和 EC 各有优缺点。EC 在处理片段化的输入 DNA（如无细胞 DNA）时表现更稳健，引起的 DNA 片段化较少；而 BC 则具有较高的转化后 DNA 回收率 。目前，由于 EC 试剂盒价格较高，且其回收效率有待提高，BC 在低模板样本检测中仍保持总体的金标准地位 。但随着技术的发展，未来可通过优化 EC 的磁珠清理步骤、使用载体 DNA 等方法提高其回收率 。此外，qBiCo 技术虽然为评估转化方法提供了有力工具，但它在检测 EC 样本时存在一定技术限制，未来需要进一步改进和优化 。总体而言，该研究为 DNA 甲基化分析中转化方法的选择提供了重要依据，有助于推动相关领域的研究进展 。