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本文全面综述了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和空间转录组学在植物研究中的应用，涵盖实验方法、计算技术和数据整合策略，探讨其优势与局限，展示了这些技术对植物细胞生物学研究的重要影响，为该领域的发展提供了全面的参考。
植物单细胞转录组研究的最新进展
植物作为复杂的多细胞生物，其不同组织和细胞类型在生长发育及环境适应过程中发挥着独特作用。传统的基因表达分析方法，如 RNA 测序（RNA-Seq），虽然能从整体层面了解植物功能，但会忽略单个细胞间的细微差异。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和空间转录组学技术的出现，为深入研究植物细胞的多样性和功能提供了新视角，极大地推动了植物生物学的发展。
单细胞转录组学的方法
scRNA-seq 在植物研究中应用广泛，可用于探究细胞发育、应激反应和器官发生等过程。然而，该技术存在空间信息丢失的问题，无法确定细胞在组织中的原始位置。早期的成像方法，如荧光激活细胞分选（FACS）、原位杂交（ISH）和激光捕获显微切割（LCM）等，虽试图解决这一问题，但各有局限性。例如，ISH 效率较低且无法获取全面的转录组数据；LCM 虽能保留空间信息，但操作繁琐、技术要求高。
作为替代方法，单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）逐渐兴起。它通过分离和测序单个细胞核中的 RNA，避免了原生质体制备过程中的时间消耗和潜在偏差，特别适用于难以分离细胞的植物组织或保存的样本。不过，snRNA-seq 捕获的转录本数量相对较少，且可能包含更多未成熟的 RNA 分子。在选择 scRNA-seq 和 snRNA-seq 时，需综合考虑研究组织类型、研究问题和样本可用性等因素。
近年来，基于液滴的方法（如 10× Genomics Chromium）和基于微孔的平台（如 BD Rhapsody）实现了大量单个细胞 mRNA 的大规模平行测序。BD Rhapsody 通过重力将单个细胞随机沉积到皮升微孔中，再利用带有细胞条形码和唯一分子标识符（UMIs）的微珠进行 mRNA 捕获、逆转录、扩增和测序。但该平台对细胞大小有限制，仅适用于小于 20μm 的细胞，影响了捕获细胞类型的多样性。Split Pool Ligation-based Transcriptome sequencing（SPLiT-seq）则提供了一种更经济、可扩展的解决方案，它无需将单个细胞分隔到独立的小室，而是利用细胞自身作为小室，操作简单且兼容固定细胞和细胞核，可减少细胞处理过程中对基因表达的干扰，还能实现灵活的细胞和样本多重分析，降低批次效应。
空间转录组学技术不断优化，能够提供更高分辨率和更广泛的覆盖范围，有助于深入理解植物组织内的基因表达模式。该技术已成功应用于兰花、杨树和玉米籽粒等多种植物的发育过程研究。例如，Slide-seq 利用独特条形码微珠实现了近单细胞分辨率的 mRNA 捕获；高清空间转录组学进一步提高了分辨率，可详细观察细胞基因表达情况。Stereo-seq 是一种分辨率达 500nm 的前沿技术，在拟南芥叶片细胞类型区分和洋葱鳞茎膨大机制研究中发挥了重要作用。不过，在植物组织中，由于细胞壁坚硬，准确界定细胞边界仍是该技术面临的挑战。此外，单分子荧光原位杂交（smFISH）技术虽具有高灵敏度和分辨率，但受植物绿色组织自发荧光和同时分析基因数量限制，在植物研究中的应用相对有限。
新兴的多组学整合
RNA 转录本、蛋白质和代谢物共同参与植物细胞的生命活动。为全面了解植物发育过程，多组学技术应运而生，它整合了基因组学、转录组学和代谢组学等不同领域的数据。已有研究利用多组学方法发现了植物新的代谢途径。例如，结合激光捕获显微切割（LCM）、RNA-seq 和质谱成像（MSI）技术，能够揭示植物组织中生物活性成分生物合成的组织特异性调控机制。
在动物研究中，联合高通量空间转录组学、scRNA-seq、单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）和 MSI 的方法已较为常见，可构建详细的发育时空图谱，揭示细胞间的相互作用和分化过程。植物科学家也在借鉴这些成果，设计更全面的实验来研究植物发育。空间 CUT&Tag 等新技术的出现，使在空间背景下研究表观遗传修饰成为可能。结合 10× Visium 空间转录组学、Stereo-seq、scRNA-seq 和 MSI 等技术，将有助于深入理解基因、蛋白质和代谢物之间的相互作用，揭示植物生长发育的复杂调控机制。
多组学技术为细胞研究提供了全面的信息，可同时分析单个细胞的遗传活性（转录组）和小分子（代谢组）。随着 MSI 技术的不断进步，有望实现对单个细胞内代谢物的定位分析，为细胞功能和组织机制的研究提供更深入的见解。不过，目前多组学分析仍面临一些挑战，如 scRNA-seq 可能遗漏低表达基因，不同数据集之间的一致性难以保证，MSI 分辨率、数据分析软件和仪器设备等方面也有待进一步改进。
单细胞转录组学在植物生物学中的应用
scRNA-seq 在植物生物学研究中具有重要意义，可识别稀有细胞类型，绘制复杂组织中的发育轨迹。研究人员利用该技术对拟南芥、玉米、水稻和棉花等多种植物的不同组织进行了研究，发现了新的细胞类型，追踪了细胞发育过程，了解了组织对环境的特异性响应机制。例如，通过分析拟南芥根细胞的单细胞转录组图谱，鉴定出多种细胞类型，并揭示了细胞周期的动态变化。
表观遗传学研究基因在不改变 DNA 序列的情况下如何进行调控，包括染色质可及性、DNA 甲基化水平、组蛋白修饰等方面。近年来，单细胞表观基因组测序技术发展迅速，如 BRIF-seq 可提供全基因组 DNA 甲基化的详细图谱，scATAC-seq 能够在单细胞分辨率下研究染色质可及性，分析 DNA 开放区域对基因表达的影响。这些技术有助于识别细胞类型特异性的调控元件，研究染色质可及性在细胞发育过程中的动态变化。结合 snRNA-seq 和染色质可及性分析等多组学方法，可进一步了解基因表达的调控机制，揭示植物生长、发育和环境响应的分子基础。
生物和非生物环境因素对植物生长和生产力有显著影响。单细胞转录组学为研究植物细胞对环境变化的响应提供了更细致的视角。研究发现，植物对不同环境刺激的响应在组织和细胞水平上存在差异。例如，在拟南芥与丁香假单胞菌的互作研究中，发现水杨酸（SA）信号通路在不同细胞类型中存在特异性激活现象；在豆科植物与根瘤菌的共生研究中，揭示了早期相互作用的动态过程和组织特异性基因表达模式。在非生物胁迫研究方面，scRNA-seq 分析显示，白菜在热胁迫下叶肉细胞中有 8000 多个差异表达基因（DEGs），拟南芥在干旱胁迫下叶肉细胞光合作用下调、表皮细胞防御基因激活，耐盐和盐敏感棉花在盐胁迫下的转录组响应也存在明显差异。此外，单细胞技术还鉴定出了细胞类型特异性的胁迫调节因子，为深入理解植物生长与防御机制的平衡提供了依据。
挑战与技术考量
植物细胞具有坚硬的细胞壁，这给 scRNA-seq 的细胞分离工作带来了困难。酶解法虽能分解细胞壁，但可能对不同细胞类型产生不同影响，导致实验结果出现偏差。因此，优化细胞分离技术至关重要，需精细调整酶的类型、浓度和处理条件等因素。同时，植物细胞大小差异较大，也可能导致数据不完整。
流式细胞术作为常用的细胞分选技术，存在样本需求量大、可能改变基因表达和影响细胞健康等局限性。基于液滴的单细胞技术因其高效性和成本效益受到广泛关注，它通过将单个细胞与带有条形码的微珠包裹在微小液滴中，可同时分析数千个细胞。
分析单细胞转录组数据需经过多个步骤，包括质量控制、数据简化和可视化等。研究人员通常使用 Seurat 等工具进行数据处理。在质量控制阶段，需去除低质量数据，如空液滴或受损细胞。由于单细胞数据复杂，包含数千个基因的表达信息，因此常采用降维技术简化数据，但这可能会引入一定程度的失真。此外，利用算法对相似细胞进行分组时，不同的技术会导致不同的分组结果。
细胞类型注释是单细胞转录组数据分析的重要环节，通常可通过已知的标记基因手动注释，但对于尚未确定标记基因的细胞类型，注释工作具有一定挑战性。为此，研究人员开发了多种计算工具来自动化和提高注释准确性，这些工具有的基于现有标记基因知识，有的则采用数据驱动的方法，但仍需进一步评估和优化，以确保其准确性和在植物单细胞研究中的广泛应用。
整合单细胞和空间转录组数据有助于更全面地理解植物生物学，但也面临诸多挑战。例如，Stereo-seq 数据仅代表组织的一个横截面，而单细胞数据涵盖组织内所有细胞类型，这使得在较大组织中准确界定细胞边界变得困难，影响数据整合的准确性。此外，Stereo-seq 从组织横截面捕获的 RNA 量有限，导致细胞捕获率较低，无法完整反映组织的细胞多样性。不同实验或批次的数据整合可能会过度校正自然生物学变异，掩盖细胞间的细微差异。当缺乏共同特征或细胞作为数据对齐的锚定时，需要采用特殊的整合方法来映射不同的细胞群体。同时，生物过程中的可变剪接会增加数据整合的复杂性。因此，开发能够识别数据集间共同参考点并考虑样本独特特征的整合方法至关重要，同时还需建立可靠的数据标准，以确保整合分析的准确性和有效性。
尽管 sc/snRNA-seq 在植物研究中得到越来越广泛的应用，但实验设计、数据分析和数据共享的标准指南仍有待完善。选择 scRNA-seq 还是 snRNA-seq 需根据具体的生物学问题和样本类型决定。scRNA-seq 可捕获全细胞转录组，但原生质体制备过程可能引入误差；snRNA-seq 虽能减少这些问题，但捕获的转录本较少且不包含细胞质 RNA。
为获得可靠的数据集，独立的生物学重复不可或缺，重复实验应考虑生长和采样条件的差异。统计分析需对重复样本进行比较，以确保数据的可靠性和可重复性。高质量的细胞或细胞核分离是实验成功的关键，原生质体制备方案需优化，以减少应激诱导的转录变化；细胞核分离虽具有灵活性，但需严格的质量控制，以避免 RNA 泄漏等问题。固定样本的方法虽能稳定样本，但可能引入偏差。研究人员需根据实验目标平衡细胞 / 细胞核数量和测序深度，全长转录本测序可提供全面数据，但资源消耗较大，3′- 或 5′- 端测序则是更经济的选择，可先进行浅度测序评估样本质量，再决定是否进行深度测序。
生成表达矩阵时，需将测序 reads 映射到基因组上，并进行质量过滤和聚类分析。映射效率取决于基因组注释质量，对于多倍体植物尤为重要。过滤标准应排除线粒体或叶绿体 RNA 含量较高的低质量细胞 / 细胞核。细胞聚类方法依赖降维技术和社区检测算法，注释过程需要已知的标记基因或参考数据集。自动化工具和物种间比较有助于注释工作，但需通过空间转录组学等技术进行验证。轨迹分析可预测植物发育或应激反应途径，在植物研究中具有很大潜力，不过实验验证（如谱系追踪或倍性分析）对于证实预测结果至关重要。公开、详细记录的数据集有助于提高研究影响力，原始数据、处理后的矩阵和元数据应存储在公共数据库（如 NCBI GEO）中，同时发表文章时应附上详细的实验方案和分析脚本，以促进研究的可重复性和元分析。
结论与展望
随着单细胞转录组分析技术的不断发展，研究人员获得的数据越来越复杂和详细。将单细胞数据与空间信息及其他组学数据整合，对于全面理解细胞在组织中的功能至关重要。scRNA-seq 虽能深入分析单个细胞，但缺乏空间背景；空间转录组学则保留了重要的空间信息，两者结合可更完整地揭示细胞组织和相互作用。
空间转录组学有望推动植物研究的发展，帮助科学家了解细胞在微环境中的功能以及对压力和疾病等挑战的响应机制。该技术还可与基因工程研究相结合，直观展示基因修饰对组织内基因表达模式的影响。尽管目前空间转录组学技术在单细胞水平捕获转录组信息存在一定局限性，但仍是解决植物研究中复杂生物学问题的有力工具。
传统上，植物细胞生物学家根据组织和细胞的外观及功能进行分类。通过比较不同物种的基因表达和转录组，人们对植物的进化关系和发育过程有了更深入的认识。单细胞转录组学进一步突破了这一局限，实现了跨物种单细胞的无偏定量比较，有助于构建特定细胞类型的进化树，了解细胞类型的演变和适应过程。不过，比较单细胞转录组学需要分析大量物种的数据，并运用计算方法识别细胞类型间的异同。随着更多植物物种单细胞数据集的积累，研究人员将能够更深入地探索植物细胞的进化历史。
单细胞转录组学为分析单个细胞的基因表达提供了强大工具，可揭示关键基因和细胞类型间的差异。然而，仅靠单细胞转录组学无法完全解释这些差异背后的机制。结合单细胞转录组数据与其他组学数据（如表观基因组学和代谢组学），研究人员可更全面地理解细胞功能。例如，将单细胞转录组学与 scATAC-seq 相结合，可揭示不同细胞类型中基因表达的调控机制。这种多组学方法有助于揭示基因表达、基因调控和细胞功能之间的联系，解释细胞基因表达差异的原因。
空间多组学技术在多组学分析的基础上增加了空间维度，不仅可分析基因表达和其他分子数据，还能将这些信息在组织中进行定位。这种整合方法为研究植物发育过程中细胞功能、相互作用以及稀有细胞类型和复杂代谢物的作用提供了更全面的视角。随着技术的不断进步，空间多组学有望加深人们对植物生长发育复杂调控机制的理解，为植物生物学研究带来新的突破。
