长链非编码 RNA CRNDE 中的超保守 snoRNA 样元件促进核糖体生物发生与细胞增殖 —— 肾癌治疗新靶点的探索

《Molecular Cell》：An ultraconserved snoRNA-like element in long noncoding RNA CRNDE promotes ribosome biogenesis and cell proliferation

本文通过 CRISPR 干扰（CRISPRi）筛选，发现长链非编码 RNA（lncRNA）CRNDE对肾细胞癌（RCC）细胞增殖至关重要。CRNDEUCE可定位于核仁，促进 60S 核糖体亚基生物发生，其机制与结合核糖体 RNA（rRNA）前体及真核起始因子 6（eIF6）相关，为癌症治疗提供新思路。

　　

研究背景

癌细胞的失控生长和增殖依赖大量核糖体以满足高水平翻译需求，肾细胞癌（RCC）中核糖体生物发生相关通路高度活跃，核仁大小和丰度增加是其重要特征。核糖体生物发生过程复杂，涉及 47S 前体 rRNA（pre-rRNA）转录、加工以及核糖体蛋白的添加等多个步骤，真核起始因子 6（eIF6）在 60S 亚基生物发生中起关键作用 。非编码 RNA 在核糖体生物发生中也有重要功能，如小核仁 RNA（snoRNAs）可引导 rRNA 修饰和加工，但其他非编码 RNA 在此过程中的作用尚不完全清楚。本研究旨在鉴定对 RCC 细胞生长至关重要的长链非编码 RNA（lncRNAs），以探索癌症治疗的新靶点。

研究方法

1. 筛选关键 lncRNA：分析 RCC 患者肿瘤 - 正常组织对的 RNA 测序（RNA-seq）数据，结合癌症细胞系百科全书（CCLE）数据，筛选出在 RCC 中高表达的 lncRNAs。构建针对这些 lncRNAs 的 CRISPRi 慢病毒单导向 RNA（sgRNA）文库，在多个 RCC 细胞系中进行 CRISPRi 筛选，确定对细胞增殖和生存至关重要的 lncRNA。
2. 验证功能及机制研究：通过拯救实验验证关键 lncRNA 的功能，利用细胞分级分离、RNA 荧光原位杂交（FISH）、预核糖体顺序提取（PSE）等实验探究其亚细胞定位。采用 RNA 反义纯化结合质谱（RAP-MS）、电泳迁移率变动分析（EMSAs）等技术确定其与相关蛋白的相互作用及结合位点。运用蔗糖密度梯度超速离心、免疫荧光、免疫沉淀等方法研究其对核糖体亚基丰度、eIF6 加载及前 rRNA 加工的影响。

研究结果

1. CRNDE 对 RCC 细胞增殖至关重要：CRISPRi 筛选发现，CRNDE是 RCC 细胞增殖所必需的。CRNDE敲低显著抑制 RCC 细胞系和原发性患者来源的 RCC 细胞生长，且不触发细胞凋亡。
2. CRNDE^UCE促进 RCC 增殖：CRNDE通过一种包含超保守元件（UCE）的异构体CRNDE^UCE在trans中发挥作用，拯救实验表明，表达CRNDE^UCE可挽救内源性CRNDE敲低后的细胞增殖。
3. CRNDE^UCE定位于核仁并促进 60S 亚基生物发生：CRNDE^UCE主要定位于核仁，CRNDE缺失导致 60S 亚基、80S 单核糖体和多核糖体水平显著下降，在 HeLa 细胞和 TERT 永生化人成纤维细胞（BJ）中也有类似现象。
4. CRNDE^UCE与 eIF6 相互作用并促进其加载：RAP-MS 和 EMSAs 实验证实CRNDE^UCE与 eIF6 直接相互作用，CRNDE^UCE缺失导致 eIF6 在核仁中积累，影响其加载到前 60S 亚基，进而阻碍后续前 rRNA 加工和前 60S 亚基的成熟与转运。
5. CRNDE 的 UCE 是类似 C/D 盒 snoRNA 的序列：CRNDE的 UCE 与 32S pre-rRNA 直接碱基配对，形成类似 snoRNP 的复合物，UCE 区域突变会破坏其与 32S pre-rRNA 的相互作用，影响 RCC 细胞生长和 60S 亚基生物发生。

研究结论

本研究揭示了 lncRNA CRNDE在核糖体生物发生中的关键作用，CRNDE^UCE通过类似 C/D 盒 snoRNA 的元件与 rRNA 前体相互作用，促进 eIF6 加载到成熟的前 60S 亚基，从而推动 RCC 细胞增殖。这一发现加深了对非编码 RNA 调控核糖体组装机制的理解，为癌症治疗提供了潜在的新靶点。同时，研究也存在局限性，如其他 CRISPRi 筛选出的候选 lncRNAs 功能有待研究，CRNDE^UCE在 3D 培养和体内肿瘤模型中的作用尚未明确等 。未来研究可进一步探索这些方向，为癌症治疗策略的开发提供更坚实的理论基础。