综述：5 - 甲基胞嘧啶（m5C）RNA 修饰在癌症及癌症化疗耐药中的作用

《Journal of Translational Medicine》：5-Methylcytosine RNA modification and its roles in cancer and cancer chemotherapy resistance

这篇综述聚焦于 5 - 甲基胞嘧啶（m5C）RNA 修饰，阐述其在癌症及化疗耐药中的关键作用。m5C 通过影响 RNA 代谢过程，参与多种癌症进程。文中探讨了 m5C 修饰的动态调控、检测方法，为癌症治疗提供了新方向，值得一读。

　　

背景

RNA 甲基化作为一种重要的表观遗传标记，在众多生物学功能中发挥关键作用。它由 “写入者” 添加甲基、“擦除者” 去除甲基以及 “读取者” 识别甲基化 RNA 共同调控。常见的 RNA 甲基化形式，如 N⁶- 甲基腺苷（m6A）、5 - 甲基胞嘧啶（m5C）等，都有可能成为疾病干预的潜在治疗靶点。RNA 修饰异常与癌症、神经退行性疾病等多种病症密切相关，深入研究 RNA 修饰机制有助于揭示基因表达的复杂性，为开发新型癌症治疗方法提供思路。

RNA 甲基化广泛存在于信使 RNA（mRNA）、转运 RNA（tRNA）、核糖体 RNA（rRNA）等多种 RNA 中。其中，m6A 在细胞分化、发育和应激反应等过程中起着重要作用，而 m5C 则在 mRNA 稳定性、核输出及翻译过程中至关重要。研究发现，RNA 甲基化调节因子在多种肿瘤中常出现紊乱，异常的 mRNA m5C 修饰参与了动脉硬化、自身免疫性疾病及癌症等多种疾病的发生发展。

尽管现代医学发展迅速，但癌症依旧是全球范围内的主要死亡原因之一。耐药性是癌症治疗的主要障碍，其产生机制复杂，涉及药物外排、代谢变化、靶点突变以及细胞逃避死亡机制等。肿瘤微环境中的缺氧、酸性条件和免疫逃逸也会对药物治疗效果产生不利影响。因此，迫切需要探索创新疗法。

表观遗传调控在介导耐药性方面发挥着重要作用，RNA 甲基化通过多种机制参与其中。例如，在肝细胞癌（HCC）中，tRNA m7G 甲基转移酶复合物成分 METTL1 和 WDR4 的上调与乐伐替尼耐药相关；m6A 在癌症耐药的多个方面发挥调节作用，影响药物运输、代谢、靶受体活性、癌症干细胞特性、DNA 修复机制和细胞凋亡等过程。深入了解这些耐药机制，对于开发针对这些修饰的新型治疗策略，提高癌症治疗效果至关重要。

研究表明，m5C 修饰与肿瘤耐药密切相关。在卵巢癌中，m5C 修饰通过招募 PABPC1 稳定 CHD3 mRNA，增强核可及性和同源重组修复效率，使肿瘤细胞对顺铂诱导的凋亡应激产生耐药性。本综述旨在探讨靶向 m5C 修饰克服耐药性、优化癌症治疗的临床潜力，重点阐述 m5C 修饰的调控因子、机制、检测方法，及其在肿瘤耐药中的重要作用和相关治疗策略。

m5C 的动态调控

m5C 修饰是一种广泛存在于 mRNA 和非编码 RNA（如 tRNA、rRNA、长链非编码 RNA（lncRNA）、微小 RNA（miRNA）、增强子 RNA 等）中的 RNA 修饰。在 m5C 修饰过程中，通常由 S - 腺苷甲硫氨酸提供活性甲基基团，添加到 RNA 中胞嘧啶碱基的 5 号碳原子位置。m5C 修饰由甲基转移酶（“写入者”）、去甲基酶（“擦除者”）和结合蛋白（“读取者”）共同介导，它们之间的相互作用实现了 m5C 甲基化的动态可逆调控，进而影响 RNA 的剪接、翻译、成熟、运输、定位及与蛋白质的相互作用等过程。

m5C 写入者

m5C 甲基化过程由 RNA 胞嘧啶甲基转移酶催化，主要包括 NOL1/NOP2/sun（NSUN）家族蛋白（NSUN1 - 7）和 DNA 甲基转移酶 2（DNMT2）。这些甲基转移酶在细胞内的定位具有高度特异性。在细胞核中，NSUN2、NSUN5、NSUN6、NSUN7 和 NOP2 主要介导 mRNA、tRNA、28S rRNA 和非编码 RNA 的 m5C 修饰；在线粒体中，NSUN2 和 NSUN3 对 tRNA 进行甲基化，NSUN4 则通过对 12S rRNA 甲基化促进线粒体核糖体组装。NSUN2 是一种主要的 RNA 胞嘧啶甲基转移酶，在细胞核、细胞质（包括核糖体和线粒体）中均有分布。

NSUN2 在多种肿瘤中高表达，参与肿瘤发生、细胞增殖、侵袭和分化等多种恶性细胞功能。例如，在乙肝病毒（HBV）感染中，宿主 NSUN2 甲基转移酶介导 HBV RNA 的 m5C 修饰，增加病毒 RNA 的稳定性，促进 HBV 复制和表达。近期研究还发现，NSUN3 介导的线粒体 tRNA m5C 修饰可增强线粒体呼吸链蛋白合成，促进癌细胞侵袭和转移；NSUN4 介导的 circERI3 m5C 修饰可增强其核输出。

TRDMT1（DNMT2）属于 5 - DNA 甲基转移酶蛋白家族，在细胞核或细胞质中均有存在。它不仅能介导 DNA 的 m5C 甲基化修饰，还能介导 tRNA 的 m5C 修饰，在真核细胞中主要介导 tRNA 第 38 位胞嘧啶的甲基化。研究表明，DNMT2 介导的 RNA 甲基化在斑马鱼和果蝇的器官分化和环境耐受性方面发挥重要作用。

m5C 擦除者

去甲基转移酶，即 “擦除者”，介导 RNA 的去甲基化，使 m5C 修饰成为一个可逆过程。近年来，液相色谱串联质谱定量分析发现，某些酶家族具有作为 RNA 去甲基酶的潜力，其过表达可显著提高 HEK293T 细胞中 RNA 5 - 羟甲基胞嘧啶（5hmC）的水平。

ALKBH1 是一种线粒体 DNA 和 RNA 双加氧酶，参与细胞质 tRNA 的去甲基化。ALKBH1 缺失会导致线粒体翻译和氧消耗严重缺陷，表明其可能对线粒体活性具有调节作用。在急性髓系白血病中，TET2 缺失会导致 TSPAN13 mRNA 中 m5C 修饰积累，被 YBX1 识别后，使转录本稳定，TSPAN13 表达增强，从而促进白血病的发生，这一过程不仅通过细胞增殖优势，还通过增加白血病干细胞的归巢和自我更新实现。研究还表明，TET 介导的氧化产物 5 - 羟甲基胞嘧啶（hm5C）在 tRNA 中特异性富集，TET2 可能通过影响 tRNA 甲基化来影响翻译过程。在过敏性鼻炎中，TET2 通过对 mRNA m5C 去甲基化负向调节 M2 相关因子，发挥保护作用。

m5C 读取者

mRNA 的 m5C 修饰通过被特定的读取蛋白识别，在多种生物学过程和疾病中发挥关键作用。识别这些 m5C 读取蛋白对于阐明影响 m5C 修饰 RNA 命运和功能的机制至关重要。目前已知的 m5C 读取蛋白包括 ALYREF、YBX1、YBX2、YTHDF2、RAD52、FMRP 和 SRSF2 等。

ALYREF 作为 m5C 读取蛋白，在膀胱癌中与赖氨酸 171 结合，促进 mRNA 外渗；在肝癌中，ALYREF 与 EGFR mRNA 的 m5C 结合，稳定 EGFR 表达，激活 STAT3 通路，促进肝癌进展。YBX1 作为 m5C 读取蛋白，参与 NSUN2 介导的 E2F1 调节，驱动卵巢癌进展；YBX2 作为 YBX1 的同源蛋白，也能与 m5C 修饰的 RNA 相互作用。YTHDF2 被鉴定为 RNA 中 m5C 的读取蛋白；FMRP 在癌症中协调 m5C 写入者和擦除者，促进 mRNA 依赖的修复和细胞存活；SRSF2 是一种新型 m5C 读取蛋白，其在白血病中的常见基因突变 SRSF2P95H 会损害其识别 m5C 标记 mRNA 的能力，减少与关键白血病相关转录本的结合，参与白血病的发生。

检测 m5C 甲基化修饰的方法

早期，液相色谱 - 质谱法用于鉴定 m5C，但该方法在检测低丰度 m5C 时存在灵敏度和可靠性方面的问题。随着高通量测序及其衍生技术的发展，如今能够在转录组范围内精确识别和定量核苷酸甲基化修饰，包括 m5C。m5C 甲基化修饰的检测方法已从液相色谱 - 质谱法发展到高通量测序技术，常见的检测方法如下：

m5C RNA 免疫沉淀测序（m5C - RIP - seq）

m5C - RIP - seq 利用特异性识别 m5C 修饰位点的抗体，通过抗体亲和层析富集含有 m5C 的 RNA 片段，用于文库构建和测序。然而，由于存在一定局限性，该方法无法识别低丰度 mRNA 上的甲基化。类似地，使用 NSUN2 特异性抗体的 miCLIP - seq 可选择性捕获 NSUN2 靶向的 RNA 片段，但由于使用针对单一 RNA m5C 甲基转移酶的抗体，且仅适用于体外细胞分析，无法获得全面的转录组图谱。

RNA 亚硫酸氢盐测序（RNA - BisSeq）

RNA - BisSeq 是目前检测 RNA m5C 甲基化修饰最常用的方法。在该方法中，样品经重亚硫酸盐处理后，mRNA 中未甲基化的胞嘧啶会转化为尿嘧啶，随后通过逆转录生成 cDNA，从而识别 m5C 修饰位点。该技术具有单核苷酸分辨率和准确预测甲基化水平的优势，但无法有效区分由 m5C 或 hm5C 衍生而来的未转化胞嘧啶。此外，亚硫酸氢盐只能转化单链胞嘧啶，部分双链 RNA 形成可能导致转化不完全，从而误识别为甲基化胞嘧啶。

超快速亚硫酸氢盐测序（UBS - seq）

与 DNA 中的 m5C 相比，mRNA 中的 m5C 修饰位点较少且水平较低，这给 RNA 亚硫酸氢盐测序带来了避免假阳性、减少 RNA 降解和准确检测 m5C 位点等挑战。芝加哥大学 Chuan He 团队开发的 UBS - seq 使用亚硫酸氢铵，提高了亚硫酸氢盐处理效率，可快速、完全地将胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时保留 5mC，减少降解。该方法能够高效、准确地对 DNA 和 RNA（包括单细胞样本）进行测序，降低背景噪声和假阳性，为研究 m5C 介导的生物学功能提供了有力工具。

m5C - TAC - seq

Li Xiao yu 等人开发了一种名为 m5C - TAC - seq（TET 辅助化学标记实现的 m5C 检测策略）的新型检测技术，该技术无需进行亚硫酸氢盐处理，能够在转录组范围内以单碱基分辨率准确、灵敏地检测 m5C。该技术结合优化的 TET 酶促反应将 RNA m5C 氧化为 f5C，然后用氮杂吲哚进行化学标记以直接检测。研究人员利用 m5C - TAC - seq 观察到小鼠胚胎干细胞分化过程中 m5C 甲基化下调，尤其是在与细胞周期和分裂相关的转录本中，表明 m5C 在细胞分化中发挥作用。该方法可检测低丰度、低序列复杂性和低修饰比例的 RNA，有助于动态监测 m5C 修饰在各种生物学过程中的变化，深入了解 m5C 修饰的生物学功能。

不同的 m5C 检测方法在不同研究背景下各有适用性。miCLIP - seq 虽然对 NSUN2 介导的 m5C 具有特异性，但对转录组的覆盖范围有限，主要适用于体外研究。目前，测序深度和生物信息学方面的技术瓶颈正在不断突破，以减轻这些限制，提高这些技术在研究和临床应用中的实用性。

m5C 与癌症进展

研究表明，RNA 修饰 m5C 与癌症进展密切相关。m5C 修饰及其调节因子（包括写入者、擦除者和读取者）在多种癌症中异常表达，促进肿瘤的发生和发展。m5C 的作用与 DNA 甲基化和基因表达调控相关，其模式改变可能影响癌细胞的增殖、迁移和耐药性。在多发性骨髓瘤中，NSUN2 和 YBX1 介导的 m5C 修饰上调 lncRNA MALAT1，后者通过外泌体运输到破骨细胞，促进骨损伤。m5C 改变对癌细胞行为的调节至关重要，可能影响肿瘤对治疗的耐药性发展。

大多数 m5C RNA 甲基化调节因子在癌症中表现出差异表达和预后价值。在验证集和 CGGA 队列中，m5C 相关特征在预测胶质瘤患者生存方面的重要意义得到了证实。

m5C 与化疗耐药

化疗是治疗癌症的有效方法之一，尤其对于晚期恶性肿瘤患者具有重要临床意义。然而，癌细胞对化疗药物的耐药性极大地限制了化疗的整体疗效。癌症耐药由多种因素引起，包括药物敏感性的个体差异、肿瘤位置、组织谱、肿瘤侵袭性以及细胞内分子变化等。越来越多的研究表明，m5C 修饰可能是肿瘤对化疗反应的潜在决定因素，在癌细胞对化疗的反应中起着关键作用。研究还发现，m5C 通过影响 DNA 修复、细胞凋亡和自噬等适应性反应、细胞干性、肿瘤免疫环境以及非编码 RNA 等方面发挥耐药作用。

铂类药物

铂类化合物顺铂于 1978 年被美国食品药品监督管理局批准用于治疗转移性睾丸癌、卵巢癌和膀胱癌。第二代铂类药物卡铂和第三代奥沙利铂是多种癌症化疗方案的主要组成部分。尽管铂类药物是临床癌症治疗的一线化疗药物，但耐药性严重限制了其临床应用。

近期研究揭示，m5C 修饰及其调节因子可调节癌症对顺铂的耐药性。抑制 m5C 读取蛋白 YBX1 可显著增强卵巢癌对铂诱导应激的敏感性，表明靶向 YBX1 可能是克服卵巢癌铂耐药治疗的潜在策略。SIAH1 过表达可增强顺铂在体外和体内的抗肿瘤疗效，但 YBX1 的异位表达或其泛素化缺失会部分削弱这种增强作用，SIAH1 与 YBX1 的相互作用可能是克服上皮性卵巢癌化疗耐药的潜在治疗靶点。在食管鳞状细胞癌中，一种由 NSUN2 甲基化的新型 lncRNA（NMR）显著上调，它是肿瘤转移和耐药的关键调节因子。在骨肉瘤细胞中，顺铂和多柔比星诱导凋亡过程中，DNMT1 和 NSun2 水平呈负相关，DNMT1 可沉默 NSUN2，减少其对 NOTCH2、AXL 和 YAP1 mRNA 的甲基化，影响细胞凋亡过程。调节 DNMT1 或 NSUN2 可调节骨肉瘤的耐药性。下调 NSUN2 可增强胃癌对化疗药物的敏感性，调节 Bcl - 2 和 Bax 的表达水平，并抑制 ERK1/2 诱导的细胞增殖。在未分化甲状腺癌中，tRNA m5C 甲基转移酶 NSUN2 表达上调，促进癌细胞去分化，抑制 NSUN2 可增强肿瘤对基因毒性药物的敏感性。

替莫唑胺（TMZ）

TMZ 是一种与铂类药物不同的烷基化剂，是晚期胶质瘤标准治疗方案中与放疗联合使用的一线化疗药物。由于胶质瘤对 TMZ 存在固有和获得性耐药，该方案治疗胶质母细胞瘤的总体临床疗效不佳。

在胶质瘤中，NSUN6 与 NELFB 和 RPS6KB2 相互作用，共同调节胶质母细胞瘤细胞对 TMZ 治疗的适应性。NSUN6 水平升高可促进肿瘤细胞在化疗中的存活，提示靶向 NSUN6 可能提高胶质母细胞瘤的治疗效果。

蒽环类药物

蒽环类药物是治疗多种血液系统和实体肿瘤常用的抗肿瘤药物，可单独使用或与靶向治疗药物或细胞毒性药物联合使用。多柔比星及其衍生物表柔比星广泛用于治疗乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、儿童实体瘤、软组织肉瘤以及侵袭性淋巴细胞或髓细胞白血病等。

在人类癌症中，NSUN2 和 METTL1 同时过表达较为常见，提示靶向这两种蛋白可能是一种有效的癌症化疗策略。过表达去磷酸化形式的这些甲基转移酶会降低对 5 - 氟尿嘧啶（5 - FU）的敏感性。

5 - 氮杂胞苷

胞嘧啶类似物 5 - 氮杂胞苷和地西他滨具有去甲基化作用，正被开发用于癌症的表观遗传治疗。研究表明，RNA 甲基化模式的改变可导致基因表达和染色质结构改变，进而影响 5 - 氮杂胞苷的疗效。耐药白血病细胞与敏感细胞相比具有不同的甲基化谱，表明甲基化状态是耐药性发展的关键因素。

在髓系白血病中，5 - 氮杂胞苷抑制 RNA 甲基转移酶 DNMT2，进而抑制 tRNA（Asp）中第 38 位胞嘧啶的甲基化，提示 tRNA 低甲基化可能与药物敏感性有关。这些发现表明，靶向 RNA 甲基化途径可能为克服 5 - 氮杂胞苷耐药性、改善白血病患者治疗效果提供新途径。

m5C 与靶向治疗耐药

靶向治疗是癌症治疗的革命性方法，通过干扰癌症生长、扩散和进展过程中的特定分子发挥作用。许多靶向药物已获得 FDA 批准，并在治疗肝癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等多种癌症中显示出显著的临床益处。然而，靶向治疗耐药性常常出现，主要原因包括靶点突变、替代信号通路激活以及细胞适应性变化等。

EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（EGFR - TKIs）

EGFR - TKIs 是一类小分子药物，靶向 EGFR 的酪氨酸激酶结构域，通过阻断 EGFR 信号通路有效抑制肿瘤生长。目前已有三代 EGFR - TKIs。

近期研究发现，YAP 的 m5C 修饰及其促进外泌体分泌的功能与肺腺癌细胞的恶性表型和对 AZD9291（第三代 EGFR - TKI）的耐药性有关，阻断 YAP 的 m5C 修饰可能对肺腺癌治疗有益。在非小细胞肺癌中，异常的 m5C 高甲基化在介导对吉非替尼（一种 EGFR 抑制剂）的耐药中起关键作用。NSUN2 甲基转移酶增强特定 mRNA<