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本文通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析大鼠淋巴液免疫细胞，发现 CD4+Icos+ T 细胞在脓毒症早期抑制炎症，其缺失影响调节性 T 细胞（Tregs）产生和脓毒症进展，转录因子 Npas2 调控该细胞分化，为脓毒症治疗提供新方向。
研究背景
脓毒症是一种危及生命的疾病，由宿主对感染的免疫反应失调引发器官功能障碍，免疫细胞凋亡增加了二次感染风险。尽管对脓毒症有一定了解，但免疫反应失调机制仍不明确。抗原呈递细胞在免疫反应启动中起关键作用，了解脓毒症进展中免疫细胞动态变化对开发治疗策略至关重要。
淋巴系统在免疫中作用重大，能收集代谢废物、促进免疫细胞循环，帮助减轻组织损伤和炎症。然而，淋巴组织中免疫细胞的全面特征尚未明确。T 淋巴细胞在脓毒症发病机制和预后中至关重要，但其在脓毒症中的动态变化及作用仍有待深入研究。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）可用于识别细胞类型，助力研究疾病的生理和病理过程。
实验方法
- 实验动物及分组：选用 8 - 12 周龄雄性 Sprague - Dawley（SD）大鼠、Icosfl/fl小鼠和 CD4+T 细胞特异性 Icos 基因敲除（Icosfl/flCd4 - CreERT2）小鼠，设置假手术组（sham）和盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的脓毒症组。
- 模型构建：通过 CLP 手术构建脓毒症动物模型，术后观察动物状态，记录生存情况和小鼠脓毒症评分（MSS）。
- 样本采集：术后 24 小时收集大鼠胸导管淋巴液、外周血单个核细胞（PBMCs）等样本。
- 单细胞 RNA 测序：对淋巴液样本进行 scRNA - seq，分析细胞组成、基因表达差异等，进行细胞注释、功能分析、轨迹分析等。
- 细胞相关实验：包括细胞分离、流式细胞术分析、细胞凋亡检测、T 细胞分化实验、过继转移实验等，研究细胞功能和相互关系。
- 分子生物学实验：进行 RNA 提取、定量实时 PCR（qPCR）、Western Blot、双荧光素酶报告基因检测、电泳迁移率变动分析（EMSA）等，探究基因表达调控机制。
- 临床样本分析：收集健康人和脓毒症患者的 PBMCs，检测 ICOS 和 FOXP3 mRNA 水平，评估 ICOS 表达与脓毒症严重程度及预后的关系。
实验结果
- 淋巴液免疫细胞图谱及转录变化：scRNA - seq 分析发现淋巴液中有 CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、B 细胞、浆细胞和中性粒细胞等主要细胞类型，T 细胞占比超 75%。CLP 组中性粒细胞比例高于 sham 组。差异表达基因（DEGs）分析显示，CLP 组上调的 DEGs 主要参与白细胞介导的免疫和对细菌的防御反应，下调的 DEGs 主要与 T 细胞激活和增殖调节有关。
- T 淋巴细胞特征及脓毒症相关亚群：T 细胞可分为 9 个亚群，其中 CD4_Icos 亚群在 CLP 组比例显著降低。功能分析表明，CD4_Icos 在 T 细胞激活和分化中起重要作用，其相关功能在脓毒症时下降。轨迹分析显示 CD4_Icos 可能是 Tregs 的前体，脓毒症时其比例降低导致 Tregs 产生减少和抗炎反应受损。
- CD4+Icos+T 细胞的抗炎作用：过继转移实验表明，将 CD4+Icos+T 细胞转移到 CLP 大鼠体内，可提高生存率、降低 MSS 评分、增加 Tregs 比例、调节细胞因子水平、减轻组织损伤，抑制过度炎症，缓解脓毒症进展。
- Icos 缺陷对脓毒症的影响：Icosfl/flCd4 - CreERT2小鼠在 CLP 诱导的脓毒症中，死亡率升高、疾病严重程度增加、Tregs 数量减少、炎症反应加剧、器官损伤更严重，表明 Icos 在脓毒症中起关键保护作用。
- CD4+Icos+T 细胞向 Tregs 分化：体外实验显示，CD4+Icos+T 细胞在 Treg 极化条件下，可促进 Foxp3+CD4+细胞产生和 IL - 10 分泌，而 Icos 缺陷则会抑制这一过程。
- Npas2 对 CD4+Icos+T 细胞分化的促进作用：通过 pySCENIC 分析发现 Npas2 是与 CD4_Icos 相关性最强的转录因子。实验表明，Npas2 可调节 Icos 表达，促进 CD4+Icos+T 细胞分化，其过表达可降低促炎细胞因子水平，增加抗炎细胞因子 IL - 10 水平。
- CD4+ICOS+T 细胞与人类脓毒症进展的关系：临床样本分析显示，脓毒症患者 PBMCs 中 CD4+ICOS+T 细胞比例显著低于健康人，ICOS mRNA 水平与 SOFA 评分呈负相关，与 FOXP3 mRNA 水平呈正相关，且是脓毒症患者 90 天死亡率的独立预测因子。
研究结论
本研究利用 scRNA - seq 分析淋巴液免疫细胞，揭示了淋巴液在脓毒症发病机制中的新作用。发现 CD4+Icos+T 细胞在脓毒症早期抑制炎症，其通过促进 Tregs 分化和 IL - 10 产生发挥作用。Npas2 作为关键转录因子，调节 Icos 表达，影响 CD4+Icos+T 细胞功能。这些发现为脓毒症治疗提供了潜在的新靶点和策略，但研究存在局限性，如未探讨脓毒症后期其他免疫细胞的作用，CD4+Icos+T 细胞向 Tregs 转化的体内追踪尚未完成等，未来研究可在此基础上进一步深入。
