肺心肺祖细胞发育时空细胞图谱：解锁心脏与肺发育的神秘密码

本文通过联合谱系追踪和时间序列单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）研究心肺发育，发现 Wnt2+心肺中胚层祖细胞（CPPs）是异质祖细胞群，可产生多种心脏和肺谱系。WNT2 缺失会导致肺毛细血管简化和心室发育不全，该研究为心肺发育提供了分子和细胞路线图。

　　

研究背景

在器官发生过程中，心脏和肺的共同发育由围绕心脏和前肠内胚层的中胚层细胞群介导，该中胚层对心肺发育至关重要，其中的心肺祖细胞（CPPs）表达Wnt2，能分化为心脏和肺的中胚层细胞谱系。尽管如此，指导 CPPs 特化的机制仍不明确。此前研究虽利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）等技术生成了心脏和肺发育的细胞图谱，但对心肺发育早期阶段的时空细胞命运以及驱动心脏和肺中胚层谱系特化的分子机制了解有限。

研究方法

1. 谱系追踪和细胞分选：在怀孕的Wnt2^+/CreERT2;R26R^EYFP雌性小鼠 E8.5 时，通过腹腔注射他莫昔芬诱导重组。在 E10.5、E12.5 和 E17.5 收集心脏和肺组织，制备单细胞悬液，利用荧光激活细胞分选（FACS）分离出表达增强黄色荧光蛋白（EYFP⁺）的细胞。
2. 单细胞 RNA 测序及分析：对分选后的细胞进行 scRNA-seq，将测序数据与 NCBI RefSeq GRCm39 基因组比对并定量。通过一系列数据处理和分析步骤，包括去除低质量细胞和基因、校正环境 RNA、归一化处理、识别高可变基因、主成分分析（PCA）、批次校正、生成细胞邻域和二维均匀流形近似与投影（UMAP）、细胞聚类等，确定细胞类型和谱系。同时，进行伪时间轨迹推断和差异基因表达测试，还将本研究的 scRNA-seq 数据与其他研究数据整合分析。
3. 实验验证：运用 RNA 荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）等实验方法，对细胞类型和基因表达进行空间定位和验证。例如，通过 RNA FISH 确定Wnt2等基因的表达域，用 IHC 检测特定蛋白的表达，以此验证 scRNA-seq 的结果。

研究结果

1. CPPs 对心脏和肺谱系的贡献：研究发现，Wnt2⁺ CPPs 不仅能产生先前已知的细胞群体，还包括肺毛细血管内皮细胞、间皮细胞、心脏心外膜和心包细胞以及心室心肌细胞（CMs）等多种未被充分认识的细胞群体。在心脏中，E17.5 的心脏样本包含多种细胞类型，如内皮细胞、周细胞、成纤维细胞等，还发现了两种不同的心室 CM 群体，其中 CM1 为不成熟的 CM 亚群。在肺中，E17.5 的肺数据集鉴定出 11 种细胞群体，包括远端毛细血管内皮细胞等，并且通过实验验证了这些细胞的存在和定位。
2. Wnt2⁺ CPPs 的细胞命运决定：通过谱系追踪和伪时间分析表明，Wnt2⁺ CPPs 在 E10.5 时就开始向心脏和肺谱系分化，可分为心肌细胞（CM）分支、中胚层分支和间皮 / 心外膜分支。此外，研究还发现Wnt2⁺ CPPs 是一个异质的细胞群体，在早期发育阶段，它们在转录组上表现出相似性，但通过与其他研究数据整合分析，发现它们存在于多个不同的祖细胞簇中。
3. 转录因子对 CPP-derived 细胞群体的调控：通过细胞区室差异基因表达分析，确定了不同发育阶段指导 CPP 细胞命运的转录因子程序。在早期发育（E10.5）时，Wnt2⁺ CPPs 表达高水平的Osr1、Foxf1等转录因子；到 E12.5 时，CPPs 消失，各细胞区室在发育过程中维持独特的转录因子 repertoire。例如，Sox17和Sox18对内皮细胞发育重要，Ppargc1和Smyd1对心肌发育关键等。
4. Wnt2缺失对心肺发育的影响：Wnt2功能缺失突变体研究显示，与对照组相比，突变体心脏的 CMs 和内皮细胞减少，Wnt2⁺中胚层、平滑肌和周细胞增加，心室厚度减小，出现心室发育不全。在肺中，表现为肺泡简化，毛细血管内皮细胞密度略有降低，但总内皮细胞数量无差异。同时，通过差异基因表达分析发现，与内皮生长和成熟相关的多个基因在Wnt2突变体肺中显著下调。

研究讨论

1. 研究的重要意义：本研究结合体内谱系追踪和 scRNA-seq，提供了全面的心肺中胚层祖细胞分化发育细胞图谱，明确了许多之前未被认识的 CPPs 后代细胞，有助于理解心肺发育的早期和晚期分子机制，为研究心脏和肺的发育提供了重要的数据基础。
2. Wnt2⁺ CPPs 在心脏和肺发育中的作用：研究进一步明确了Wnt2⁺ CPPs 在心脏和肺中胚层细胞特化中的作用。在心脏方面，其对晚期中胚层谱系分配、CM 身份和成熟的决定因素研究有重要意义；在肺中，不仅确认了已知的 CPP-derived 细胞类型，还发现了新的远端毛细血管内皮细胞和间皮细胞的来源，为肺中胚层发育研究提供了新的视角。
3. CPPs 的异质性探讨：关于Wnt2⁺ CPPs 是作为共同的早期中胚层祖细胞群体还是异质群体存在争议。本研究结果表明，CPPs 是异质的细胞类型，但可能仍存在一小部分具有分化为心脏和肺谱系能力的祖细胞，未来可借助条形码标记技术进一步研究。
4. WNT2 对心肺发育的影响及研究局限性：WNT2 对 CM 发育和肺成熟有促进作用，Wnt2缺失会导致心室心肌发育不全和血管发育异常。然而，本研究存在一定局限性，可能未标记所有Wnt2⁺ CPP-derived 细胞，使用组成型Wnt2^Cre或其他 CPP 特异性基因启动子驱动的 Cre 重组酶可能会改善标记效率，更全面地研究 CPPs 对心肺细胞命运的贡献。}