探秘人类视网膜发育：睫状边缘区（CMZ）维持视网膜祖细胞至妊娠晚期的关键意义

《Cell Reports》：Ciliary marginal zone of the developing human retina maintains retinal progenitor cells until late gestational stages

这篇研究聚焦人类视网膜发育，发现发育中的人类视网膜睫状边缘区（CMZ）存在增殖细胞群。通过多种实验手段，揭示其包含早晚期祖细胞，细胞周期较长，且对转化生长因子 β（TGF-β）抑制反应独特。研究为理解视网膜发育及相关疾病治疗提供重要依据。

　　

人类视网膜睫状边缘区研究背景

视网膜的发育在时间和空间上高度协调，其中的细胞大多源自共同的祖细胞池。在非哺乳动物脊椎动物中，视网膜远周边存在睫状边缘区（CMZ），其能在胚胎后继续增殖并产生新神经元，对视网膜再生意义重大。然而，在成年小鼠和人类中，此前未明确存在类似的增殖区域。虽有研究提示人类胎儿视网膜存在 CMZ 样区域，但由于技术限制，对其在发育后期的特征及与其他物种类似区域的相似性了解甚少。

实验方法

1. 组织样本获取：研究使用了 40 多个人类胎儿视网膜和 4 个猕猴视网膜样本。人类胎儿视网膜组织取自华盛顿大学的出生缺陷研究实验室，通过超声和胎儿身体特征估计胎龄，性别在实验中尽量平衡。猕猴组织则来自经加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的实验，通过时间交配和超声确认胎儿发育正常后获取。
2. 培养与检测技术：运用视网膜球（retinospheres）培养方法，将胎儿视网膜组织切成小块在特定培养基中培养，可维持视网膜特定空间身份并继续发育。采用免疫荧光染色技术，使用多种抗体（如 VSX2、PAX6 等）标记细胞，结合 5 - 乙炔基 - 2′ - 脱氧尿苷（EdU）标记新合成 DNA，以观察细胞增殖和分化情况。此外，还运用了单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）技术分析细胞类型和基因表达特征。

实验结果

1. CMZ 区域的鉴定与特征：在人类胎儿 120 天发育时，视网膜远周边区域与相邻组织不同，缺乏分化细胞的分层结构，且存在共表达 VSX2 和 PAX6 的视网膜祖细胞（RPCs），该区域类似其他物种的 CMZ。通过视网膜球培养实验发现，直至 238 天，该区域仍保持类似 CMZ 的特征，证实视网膜球可可靠模拟胎儿视网膜的 RPC 标记。
2. CMZ 细胞的增殖活性：实验表明，CMZ 细胞在视网膜其他区域停止增殖后仍保持有丝分裂活性。在不同时间点向视网膜球添加 EdU 标记，发现直至 350 天（相当于 2.5 个月的产后发育），CMZ 区域仍有增殖细胞，而周边视网膜区域增殖细胞极少。非人类灵长类动物（NHP）研究也显示，在相当于人类 260 天妊娠的阶段，CMZ 区域仍有增殖细胞标记物表达，这表明 CMZ 区域可能持续存在至出生。
3. CMZ 中早晚期祖细胞的存在：对 185 天等效妊娠的 CMZ 和周边视网膜进行 scRNA - seq 分析，发现 CMZ 存在独特的细胞簇，包含早期和晚期 RPCs。通过基因表达分析，鉴定出了早晚期祖细胞的标记基因，且发现 CMZ 能同时产生早期（如神经节细胞）和晚期（如视杆细胞和 Müller 胶质细胞）的视网膜细胞类型，直至 220 天等效妊娠。
4. CMZ 祖细胞的细胞周期特性：进行定时 EdU 脉冲实验，结果显示 CMZ 中 RPCs 的细胞周期约为 16 小时，长于周边视网膜 RPCs 的约 11 小时，这与其他物种的 CMZ 情况相似。
5. TGF-β 对 CMZ 细胞的影响：用 TGF-β 受体激酶抑制剂（TGF-βi）处理 CMZ - 包含的视网膜球，发现其可使远周边视网膜的增殖细胞数量显著减少，但对 CMZ 区域的早期 RPCs 无明显影响。TGF-βi 还影响了视杆细胞的分化速率，使视杆细胞分化减少。进一步研究发现，早期祖细胞对 TGF-β 信号的反应可能较弱，因为其相关受体和信号转导因子表达较低，而抑制 TGF-β 信号的蛋白表达较高。

研究讨论

1. 研究成果的意义：研究扩展了对人类视网膜 CMZ 的认识，确定其在妊娠晚期仍维持早晚期 RPCs，并能产生不同类型的视网膜细胞。这有助于深入理解视网膜发育过程中神经发生的时间和空间调控机制，为解释视网膜细胞的产生和分化提供了新的视角。
2. 对相关疾病治疗的启示：更好地了解人类视网膜中 RPCs 的类型及其增殖调控机制，对开发治疗青光眼、黄斑变性等致盲性疾病的再生疗法具有重要意义。例如，通过研究 CMZ 中 RPCs 的特性，可能找到促进视网膜细胞再生的方法，为恢复患者视力提供新的途径。
3. 研究的局限性：研究存在一定局限性。多数晚期时间点的数据来自体外培养的视网膜球，虽然与体内组织有较好相关性，但缺乏直接的体内组织比较，如特定孕周的 RNA - seq 数据和产后组织的组织学数据。此外，在解剖 CMZ 区域进行培养时，会连带部分色素睫状体，这虽可能有利于维持 CMZ 的生理状态，但也给实验带来了额外变量，未来需要进一步研究去除色素睫状体对 RPCs 增殖的影响。