综述：免疫检查点调控急性髓系白血病干细胞

《Leukemia》：Immune checkpoints regulate acute myeloid leukemia stem cells

这篇综述聚焦急性髓系白血病（AML），深入探讨免疫检查点（ICs）对白血病干细胞（LSCs）的调控作用。详细阐述 ICs 在 LSCs 中的表达、功能及临床意义，分析 IC 阻断疗法在 AML 中的现状与挑战，为 AML 治疗提供新的靶点和思路。

　　

引言

急性髓系白血病（AML）是一类异质性血液恶性肿瘤，其特征为骨髓（BM）和外周血中未成熟髓细胞迅速增殖和积累，最终破坏正常造血功能，导致骨髓衰竭。白血病干细胞（LSCs）与正常造血干细胞（HSCs）共享骨髓微环境，且具有自我更新和分化为白血病母细胞的能力，同时能抵抗化疗和免疫监视，是白血病发生、维持和复发的关键因素。LSCs 所处的骨髓微环境由多种细胞类型和细胞外基质成分组成，且骨髓也是免疫器官，各种免疫细胞与 LSCs 紧密相邻。免疫细胞和微环境中的细胞通过分泌细胞因子等方式，对 LSCs 的增殖、自我更新和分化产生重要影响。此外，LSCs 表达主要组织相容性复合体（MHC）I 类和 II 类分子以及多种免疫检查点分子，在调节骨髓免疫反应的同时，这些免疫检查点分子还直接调控 LSCs 的功能，这也是本综述的重点内容。

免疫检查点分子（IC）及 IC 信号传导

免疫检查点分子（IC）涵盖多种细胞表面蛋白和聚糖结构，包括受体和配体，对免疫反应起共刺激或共抑制作用。其中，大多数 IC 属于免疫球蛋白超家族（IgSF）和肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）及其相应配体（TNFSF）。

1. IgSF 的结构与信号传导：IgSF 包含 700 多种细胞表面和可溶性蛋白，其成员至少含有一个免疫球蛋白结构域，该结构域稳定性高，适合配体结合，参与细胞识别、黏附、发育过程以及先天性和适应性免疫反应。目前已知有 30 多个 IgSF 成员具有免疫调节作用，可被归类为 IC 分子。根据结构和功能，IgSF 的 IC 分子可进一步分为不同亚家族，如 CD28、B7、SLAM 家族等。尽管部分 IC 分子的免疫球蛋白和其他结构域相似，但它们的细胞内信号转导域可能存在显著差异，从而产生不同的功能效应。例如，CD28 和 CTLA-4 都属于 CD28 IgSF 亚家族，序列相似度高，但 CD28 是 T 细胞激活的关键共刺激信号，而 CTLA-4 则通过与相同配体高亲和力结合，招募磷酸酶抑制 CD28 信号，对 T 细胞激活起抑制作用 。IgSF 的 IC 信号传导通常涉及细胞内基于免疫受体酪氨酸的调节基序（ITRMs），包括激活基序（ITAM）、抑制基序（ITIM）和开关基序（ITSM），其功能取决于细胞环境。配体结合后，ITRM 和其他含酪氨酸基序被 Src 家族激酶磷酸化，进而招募含 SH2 或 SH3 结构域的蛋白，传递激活或抑制信号。
2. TNFRSF/TNFSF 的结构与信号传导：TNFRSF 包含 29 个受体，TNFSF 包含 19 个配体，它们参与细胞增殖、分化、存活和免疫系统调节等多种生物学过程。TNFSF 成员的特征是存在 TNF 同源结构域（THD），可介导配体三聚化以发挥功能；TNFRSF 成员至少含有一个保守的富含半胱氨酸结构域（CRD），用于受体三聚化和配体相互作用 。TNFSF 成员多以膜结合形式合成，多数可被蛋白酶切割形成可溶性变体，但并非所有可溶性形式都能激活相应受体信号。TNFRSF 成员根据细胞内相互作用伙伴可分为死亡受体（DRs）、TRAF 相互作用受体和诱饵受体（DcRs）。DRs 的细胞质尾部含有死亡结构域，可与死亡结构域结合蛋白相互作用，除诱导细胞凋亡外，还能激活 NFκB 和 MAP 激酶等细胞通路；TRAF 相互作用受体含有短基序，可招募 TNF 受体相关因子（TRAFs），参与 Toll 样受体、NOD 样受体和部分细胞因子受体家族的信号转导；DcRs 缺乏完整的细胞内信号传导结构域或为分泌蛋白，主要通过竞争性结合 TNFSF 配体发挥作用，部分 TNFRSF 成员的裂解形式也可作为诱饵受体 。总体而言，IC 信号传导非常复杂，存在受体与配体重叠结合、信号效应依赖细胞环境、存在正向和反向信号传导以及配体和受体可被裂解产生不同功能的可溶性形式等多种情况。

免疫检查点抑制剂在 AML 治疗中的应用

AML 具有免疫原性，免疫细胞可识别并清除白血病母细胞和 LSCs，这在异基因造血干细胞移植（alloHSCT）后体现得尤为明显，T 细胞可针对次要组织相容性抗原发挥移植物抗白血病效应。基于此，使用免疫检查点抑制剂（ICIs）增强 T 细胞活性成为治疗 AML 的一种策略，多项临床试验已开展或正在进行中。然而，与实体瘤相比，ICIs 在 AML 治疗中的疗效有限。例如，在复发 / 难治性 AML 中，PD-1 阻断抗体派姆单抗和纳武单抗与低甲基化药物阿扎胞苷联合使用，虽诱导了约 30% 的缓解率，但持续时间较短；PD-L1 阻断抗体度伐利尤单抗与阿扎胞苷联合治疗也未改善患者预后。ICIs 在 AML 中疗效不佳的原因可能包括 AML 的突变负荷低，导致恶性细胞的抗原性低，以及 AML 患者的 T 细胞功能障碍可能比实体瘤患者更严重。研究发现，AML 中 CD8⁺ T 细胞激活、分化和功能相关的重要基因因病理性表观遗传改变（如组蛋白去乙酰化）而下调，使得 CD8⁺ T 细胞功能障碍，这可能并非主要由抑制性分子表达所致，而是免疫激活受体的表观遗传沉默造成的。尽管阻断免疫抑制性 ICs 的抗体在 AML 治疗中效果不佳，但靶向 LSCs 上特异性表达并激活 LSCs 的 ICs，可能是治疗 AML 的一种有前景的新方法。

参与 LSC 调节的 IgSF 免疫检查点分子

1. PD-1（PDCD1）：PD-1 是 IgSF 中 CD28 亚家族的重要免疫检查点受体。在免疫细胞激活时，PD-1 表达可被诱导，其与配体 PD-L1 或 PD-L2 结合后，通过细胞内的 ITIM 和 ITSM 抑制 T 细胞受体（TCR）和 CD28 下游通路，如 ZAP70、PI3K-AKT、RAS 和 mTOR 等，最终降低转录因子 AP-1、NFAT 和 NFκB 的活性，同时增加 BATF 的表达，从而抑制免疫反应。此外，在黑色素瘤小鼠模型中，PD-1 信号通过 SHP-2 抑制髓系分化。在 AML 中，PDCD1 mRNA 和 PD-1 蛋白在髓系白血病（CMML 和 AML）患者的 CD34⁺骨髓细胞中的表达高于健康对照。AML 母细胞上 PD-1 的表达与较长的无病生存期相关，但在 MLL 和 Flt3 驱动的小鼠 AML 模型中，PD-1⁺的 AML LSKs 具有更高的植入率，会诱导更具侵袭性的白血病，缩短小鼠生存期。机制研究发现，与 PD-1^-的 AML LSKs 相比，PD-1⁺的 AML LSKs 中 SHP-1 和磷酸化（p）-ERK 水平升高，这一现象在人类 PD-1⁺ CD34⁺ AML 细胞中也得到了验证，表明 PD-1 信号在至少部分 AML 亚型中促进疾病进展。
2. PD-L1（PDCD1LG1）：PD-L1 是 PD-1 的两个已知配体之一，属于 IgSF 的 B7 亚家族。它在多种造血和非造血细胞上表达，可组成性或诱导性表达。在炎症或感染情况下，造血、内皮和上皮细胞会诱导表达 PD-L1，通过与激活的免疫细胞上的 PD-1 结合来抑制免疫反应。在癌症中，基因扩增和多种致癌驱动因素可直接诱导 PD-L1 过表达。PD-L1 由 290 个氨基酸组成，其细胞内尾部仅含 30 个保守氨基酸，缺乏传统信号基序，但在多种癌症中存在反向信号传导，与癌症的起始、进展、上皮 - 间质转化（EMT）和治疗耐药相关。在癌症干细胞（CSCs）中，转录因子 OCT4 或 SOX2 可上调 PD-L1 表达，而 PD-L1 信号激活调节干性的通路，如 PI3K/AKT/mTOR、MAPK 或 β -catenin 通路 。在 AML 中，约 20% 的成年患者和大多数儿科患者的白血病母细胞表达 PD-L1，且 LSCs 上的表达水平高于 AML 肿瘤细胞群体。PD-L1 在白血病细胞上的表达与不良生存、复发和不良风险组的细胞遗传学突变相关。例如，KMT2A（MLL1）基因重排常见于 AML，其可直接结合 PDL1 启动子激活转录；MUC1 表达的 AML 细胞系中，MUC1 通过降低 DICER 表达，减少成熟 microRNAs 的形成，从而增加 PD-L1 表达，抑制 MUC1 可上调多种 miRNAs，其中 miR-34a 和 miR-200c 可降低 PD-L1 表达 。此外，炎症介质如 TLR 配体和 IFN-γ 可增加患者来源的 AML 母细胞上 PD-L1 的表达。功能研究表明，AML 细胞系中 PD-L1 过表达可刺激糖酵解和增殖，抑制细胞凋亡；抑制 PD-L1 可降低 PI3K 和 AKT 表达，通过 G2/M 期细胞周期阻滞减少细胞增殖并诱导细胞死亡。在 MLL-AF9 驱动的小鼠 AML 模型中，PD-L1 在 Mac-1⁺/c-Kit⁺ LSCs 上的表达高于 HSCs，敲除 PD-L1 的白血病在免疫缺陷小鼠的连续移植中侵袭性降低，细胞周期停滞在 G1 期，同时磷酸化 JNK 和 Cyclin D2 减少。这些数据表明，PD-L1 在 AML 细胞上表达，除促进白血病细胞免疫逃逸外，还可通过代谢变化、增强增殖和减少细胞死亡促进肿瘤进展。
3. CTLA-4（CTLA4）：CTLA-4 是 IgSF 中 CD28 亚家族的 IC 分子，通常与 CD28 的功能相反。在常规 T 细胞激活时，CTLA-4 表达上调。在不同造血细胞类型中，CTLA-4 在细胞表面的表达较低，但在细胞质中呈强阳性，经刺激后可在细胞表面检测到。CTLA-4 的 mRNA 水平通常较低，提示其可能预先合成并存储在细胞质囊泡中。CTLA-4 与 CD80 和 CD86 的结合亲和力高于 CD28，可阻止 CD28 对免疫细胞的共刺激作用，从而发挥免疫抑制功能。此外，在健康细胞和癌细胞中，CTLA-4 还存在细胞内信号传导，可能参与调节间充质和神经干细胞及前体细胞的分化，在不同癌细胞系中可调节细胞凋亡、迁移和 EMT 。在 AML 中，与健康对照相比，AML 患者外周血单个核细胞（PBMCs）中 CTLA4 mRNA 水平升高，超过 50% 的患者可检测到细胞表面 CTLA-4 蛋白，近 100% 的患者可检测到细胞质 CTLA-4 蛋白。AML 的 TCGA 数据显示，CTLA4 表达与不良预后相关，但在新诊断和化疗耐药患者之间，CTLA4 表达无差异。CTLA4 基因 3’ UTR 区域的 SNP（CT60）与自身免疫性疾病风险增加以及 AML 患者复发率升高和总生存期缩短相关 。刺激 CTLA-4 可诱导原发性人类 AML 细胞凋亡，但目前 CTLA-4 在 LSCs 中的分子机制尚未明确。
4. CD86（CD86）：CD86，又称 B7-2，是 IgSF B7 亚家族成员，是 CD28 的第二个已知配体。与 CD80 不同，CD86 在抗原呈递细胞（APCs）上组成性表达，刺激后迅速上调。在 B 细胞中，CD86 反向信号传导可刺激细胞增殖和 IgG1、IgG2a 抗体产生；在 B 细胞淋巴瘤细胞系中，CD86 交联可增强抗凋亡信号 。在 AML 中，CD80 在 AML 细胞上不表达，约 50% 的 CD45⁺CD34⁺c-Kit⁺细胞表达 CD86。Ara-C 处理可增加原发性 AML 样本中 CD86 的表达，组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理可使 AML 细胞系和原发性样本中 CD86 表达增加，但全反式维甲酸（ATRA）刺激 AML 细胞系分化并未导致 CD86 上调 。LSD1/KDM1A 抑制可诱导 MLL 重排的 AML 细胞表达分化标记 CD11b 和 CD86，降低克隆形成能力和增殖。TCGA 数据显示，高 CD86 表达与免疫细胞基因特征及 AML 患者不良预后正相关，新诊断 AML 患者单核细胞 CD86 阳性与较差的生存率相关。体外培养数周的 AML 患者样本，其祖细胞表面标记 CD33、CD13 和 CD34 表达下降，而 CD80 和 CD86 表达增加 。目前，CD86 表达与 LSC 调节和分化的功能关系尚待确定。
5. CD276（CD276）：CD276，即 B7-H3，是 IgSF B7 亚家族的 IC 分子。其 mRNA 在大多数组织中广泛表达，但蛋白在细胞表面的表达局限于部分免疫细胞。CD276 的结合伴侣未知，它对免疫系统具有共刺激和共抑制作用。在多种癌症中，CD276 常过表达，在不同癌症中的预后意义不同，如在胃癌和胰腺癌中与较好预后相关，在非小细胞肺癌中则是不良预后标志物 。在不同实体癌细胞系中，CD276 可通过 JAK/STAT3 通路促进肿瘤进展、迁移、耐药和干性；在胶质母细胞瘤中，CD276 表达与 CSC 相关基因和 MYC 相关，被认为是 TGF-β 通路的抑制剂和 CSC 分化的调节因子 。在 AML 中，多个公共数据集显示，AML 患者样本中 CD276 mRNA 表达高于健康对照，高表达与不良生存相关。约 30% 的 AML 患者样本中，CD45⁺CD34⁺c-Kit⁺细胞可检测到 CD276，而健康供体中无表达。此外，LSCs 中 CD276 m