综述：重新定义甲型肝炎病毒感染的免疫格局

《Experimental & Molecular Medicine》：Redefining the immune landscape of hepatitis A virus infection

甲型肝炎病毒（HAV）感染仍是急性病毒性肝炎的主要病因。本文综述了 HAV 感染相关免疫反应的最新研究成果，包括 HAV 诱导的固有免疫反应、HAV 对固有免疫的反击机制，以及各类 T 细胞在病毒清除和肝损伤中的作用，为深入理解 HAV 感染的免疫机制提供了新视角。

　　### 甲型肝炎病毒（HAV）概述
HAV 是一种小的无包膜病毒，属于小核糖核酸病毒科，于 1973 年首次被发现。其基因组为 7500 个核苷酸长度的正链 RNA，具有高度的抗原保守性，仅 1 个血清型和 7 个基因型，其中 4 种可感染人类。基因组包含一个单一开放阅读框，两侧为非翻译区（UTRs），编码构成二十面体衣壳的结构蛋白以及参与病毒复制和宿主相互作用的非结构蛋白。5′ UTR 含有 III 型内部核糖体进入位点（IRES），可促进不依赖帽结构的翻译，3′ UTR 则以 poly (A) 尾结束。结构蛋白 VP1、VP2、VP3 和 VP4 形成衣壳，非结构蛋白 2B、2C、3A、3B、3C 和 3D 参与病毒复制、多蛋白加工和宿主相互作用。

HAV 主要通过网格蛋白依赖的内吞作用进入肝细胞并在其中复制。在宿主细胞的细胞质中，正链 RNA 基因组作为 mRNA 翻译为多蛋白，随后被病毒编码的 3C 蛋白酶（3C^pro）切割成单个蛋白质。HAV RNA 的复制与病毒诱导的膜状复制细胞器相关，涉及双链（ds）RNA 中间体。HAV 存在两种形式：裸病毒（nHAV）和准包膜病毒（eHAV）。所有病毒粒子均以 eHAV 形式通过非细胞溶解过程释放，类似于外泌体分泌，随后准包膜在近端胆小管中被胆汁酸去除，nHAV 形式稳定性高，便于粪口传播。

临床上，HAV 感染具有高度传染性，通常为自限性疾病，症状包括发热、乏力、呕吐、恶心和黄疸等，少数病例（不到 1%）会发展为暴发性肝炎，需要进行肝移植。虽然急性甲型肝炎（AHA）不会转为慢性，但严重病例可能导致肝衰竭，尤其在成年人和有基础疾病的患者中更为常见。全球范围内，HAV 每年导致超过 1 亿人感染，15000 - 30000 人死亡，主要通过受污染的食物和水传播。感染 HAV 后，个体可产生病毒中和抗体，提供终身保护免疫力，接种灭活病毒疫苗也能产生类似的中和抗体。自 20 世纪 90 年代以来，疫苗的使用显著控制了 HAV 感染率，灭活疫苗和减毒活疫苗均具有高效性和持久的免疫效果。

HAV 感染的免疫反应研究意义

尽管疫苗有效，但了解 HAV 与宿主免疫系统之间的相互作用仍至关重要。过去认为 HAV 会强烈抑制感染细胞的固有免疫反应，但近期研究表明，HAV 在感染的肝细胞中会引发强大的细胞内在固有免疫反应。此外，HAV 感染还会导致旁观者 CD8⁺ T 细胞激活以及调节性 T（Treg）细胞群体的异常变化。本文将结合近期研究成果，总结当前对 HAV 免疫反应（特别是固有免疫和 T 细胞反应）的认识，提供新的视角，并指出未来研究的方向。

HAV 在体外细胞培养系统中诱导的固有免疫反应

HAV 感染的典型清除过程以及疫苗的有效性表明，HAV 可诱导强大的免疫反应，但这在体外和体内的研究都较为有限。与体内急性感染的结果不同，体外培养 HAV 通常表现为缓慢且持续的感染，这是由于 HAV 在培养中生长需要长时间适应，且具有非细胞病变表型。在 HAV 适应细胞培养后，多种细胞系被证明能够支持 HAV 感染，如狨猴原代肝细胞、人肝癌细胞系 Alexander（PLC/PRF/5）和恒河猴胎儿肾细胞（FhrK6 和 FhrK4），但这些感染模型的研究主要集中在检测 HAV 复制、潜在的细胞病变效应或病毒基因组特定突变的影响，忽视了固有免疫反应。

1985 年，研究人员在 HAV 感染的人胚胎成纤维细胞中测量 I 型干扰素（IFN）α 和 β，未检测到 IFN 分泌，这表明 HAV 可能阻碍固有免疫反应。此外，HAV 感染的成纤维细胞无法消除其他病毒的感染，且少量外源性 IFN - α/β 就能根除人成纤维细胞中持续的 HAV 感染，这些发现进一步支持了这一观点。

肝嗜性（+）RNA 病毒可被肝脏中大量表达的关键模式识别受体（PRRs）识别，如维甲酸诱导基因 I 样受体（RLRs）和 Toll 样受体（TLRs），这些受体通常识别病毒复制过程中产生的 dsRNA。细胞质中的 RLRs 包括维甲酸诱导基因 I（RIG - I）、黑色素瘤分化相关基因 5（MDA5）和遗传学与生理学实验室 2（LGP2）。RIG - I 识别 5′端带有三磷酸化的短 dsRNA（<500 碱基对），而 MDA5 检测更长的 dsRNA。结合 dsRNA 后，MDA5 和 RIG - I 会发生构象变化，暴露其 N 端的半胱天冬酶激活和募集结构域（CARD），该结构域与线粒体抗病毒信号（MAVS）衔接分子相互作用，促使 TANK 结合激酶 1（TBK1）和 IκB 激酶 - ε（IKKε）磷酸化转录因子，包括 IFN 调节因子 3（IRF3）、IRF7 和 NFκB。这些激活的因子形成二聚体并迁移到细胞核，促进编码 IFN、IFN 刺激基因（ISGs）和免疫调节基因的转录。

与 RIG - I 和 MDA5 不同，LGP2 可识别各种 RNA 分子，且缺乏 CARD 结构域，它通过增强 MDA5 对 dsRNA 的识别和抑制 RIG - I 来促进固有免疫信号传导。来自人源化肝脏嵌合小鼠（PhoenixBio，PXB - 小鼠）的原代人肝细胞和恒河猴胎儿肾细胞（FRhK4）是具有免疫功能的细胞，表达生理水平的 PRRs，但最初未对它们对 HAV 的固有免疫反应进行研究。相比之下，肝癌细胞系 Huh7 的克隆显示 PRR 表达受损，对 HAV 高度易感。HAV 基因组 5′端与 VPg 共价连接，不太可能被识别游离 5′三磷酸末端 RNA 的 RIG - I 识别，而 MDA5 据报道可识别包括 HAV 在内的多种小核糖核酸病毒。Sung 等人在包括原代人肝细胞（PHH）和永生化 HepG2 细胞等免疫功能模型中证实了这一发现，在这些模型中，趋化因子 CXCL10 的诱导严格依赖于 MDA5 对 HAV 的识别。另一项研究在感染 HAV 的 HepaRG 细胞中验证了 MDA5 作为主要 HAV 传感器的作用，证明了 HAV 感染后可检测到 ISGs 和 CXCL10，并报道了 LGP2 对 HAV 传感的关键贡献。

关于 TLR3，Qu 等人报道，异位表达 TLR3 的 Huh7 细胞在 HAV 感染时未表现出 IFN 诱导，这表明病毒对衔接蛋白 TRIF 有反击作用，而非缺乏诱导。成功的 TLR3 传感依赖于 HAV dsRNA 到达内体腔，但这尚未得到实验验证。重要的是，文献还表明浆细胞样树突状细胞（pDCs）可以识别 eHAV，从而在体外基于 IFN - α 分泌和强大的 ISG 诱导引发固有免疫反应。然而，在感染 HAV 的黑猩猩中，仅短暂观察到 pDCs，且 HAV 感染时未引发 ISGs，尽管感染的黑猩猩表现出强烈的病毒血症，这一发现似乎与 HAV 通过各种蛋白质干扰固有免疫反应的能力有关。

HAV 对固有免疫的反击机制

HAV 的半胱氨酸蛋白酶 3C^pro对 P3 多蛋白前体进行分级自动加工，依次释放出单个中间体，从 3ABCD 开始，接着是 3ABC 和 3CD，最后是 3C。这些 3C 物种具有不同的稳定性，3CD 位点的加工效率据报道比 3AB 和 3BC 位点更高。所有物种都保留了蛋白水解活性和不同的底物特异性，都有可能切割参与固有免疫信号传导的多种宿主分子。

Yang 等人首次报道 3ABC^pro和 3ABCD 可以蛋白水解切割 MAVS，他们在研究中证明了 MAVS 在 HAV 感染细胞和携带 HAV 亚基因组复制子的细胞中均发生降解。进一步研究表明，3ABC 对 MAVS 的切割需要 3C^pro的蛋白酶活性以及 3A 中的跨膜结构域，该结构域将 3ABC 引导至线粒体。此外，作者通过在外部免疫刺激物存在下，使用受 IFN - β 启动子控制的荧光素酶报告基因实验，证明了 RLRs 介导的通路受到相应阻碍。Qu 等人随后采用类似模型并添加无细胞切割实验，证明了 3CD 可强烈降解 TRIF，但成熟的 3C^pro或 3ABC 前体则不能。值得注意的是，TRIF 分子不包含典型的 3C^pro共识切割位点，其含有部分匹配的位点。Qu 等人证明 3CD 介导的 TRIF 切割既依赖于 3C^pro的半胱氨酸蛋白酶活性，也依赖于下游 3D^pol序列，且与 3D^pol活性无关，但目前尚不清楚 3D 如何改变切割特异性的机制。不过，Qu 等人表明 TRIF 的缺失导致 TLR3 通路功能丧失，这一结果后来得到 Fensterl 等人的验证，他们提出 HAV 可能干扰 TBK1 和 IKKε 的磷酸化，从而降低 TRIF 下游信号传导的效率。

后来的一项研究证实了 3ABC 对 MAVS 和 3CD 对 TRIF 的蛋白水解切割，但效率比之前报道的低。重要的是，使用 HAV 亚基因组复制子细胞系、HAV 感染细胞和稳定表达不同 HAV 蛋白酶物种的细胞进行实验，未检测到固有免疫功能的丧失。在这些细胞中，尽管 HAV 蛋白酶前体大量表达，但 TLR3 和 RLR 通路仍然完整，并对免疫刺激剂的处理有反应。

随着研究的深入，不断有新的观点出现。Hirai - Yuki 的一项重要研究表明，野生型小鼠中 MAVS 基因敲除（KO）会增加对 HAV 感染的易感性，这表明逃避 RLR 通路是 HAV（和其他病毒）在固有免疫反应和 RLR - IRF3 轴介导的炎症中存活的关键策略。然而，Sun 等人最近发现，用包含 HAV 3ABC 特定切割位点的 “人源化 MAVS” 分子重建 MAVS KO 小鼠后，它们对 HAV 感染的易感性并未增加，这一重要的体内证据表明 MAVS 切割对 HAV 感染的成功可能并不像之前认为的那么关键。此外，Hirai - Yuki 报道，完全消除 TLR3 通路的 TRIF KO 小鼠对 HAV 感染的易感性并未增加。

在另一项研究中，Wang 等人证明 NEMO 会被 3C^prc直接切割，导致 TLR3 - IRF3 通路中断和 IFN - β 转录下调，但需要进一步研究来阐明 NEMO 切割的功能影响。

除了蛋白酶依赖的机制，HAV 还采用其他策略来消除宿主免疫反应。非结构蛋白 HAV 2B 能够破坏 TBK1/IKKε 激酶活性，Paulmann 等人认为 TBK1 和 MAVS 可能受到 HAV 蛋白 2B 和 3ABC 的协同作用影响，但确切机制仍有待阐明。此外，最近有报道称 HAV 感染会增加 microRNA hsa - miR - 146a - 5p 的表达，它靶向并降解 TRAF6 mRNA，影响 IFN - β 合成并增加病毒复制。

总体而言，HAV 显然能够通过多种机制对抗固有免疫，但似乎没有一种机制能完全消除相关通路，因此在 HAV 感染时，IFN 和 ISG 反应仍然会发生。

HAV 在体内模型中诱导的固有免疫反应

在固有免疫研究中，人们利用多种动物模型对 HAV 感染进行了探索。灵长类和非人灵长类动物，如黑猩猩、狨猴和夜猴，由于与人类相似，为研究提供了有价值的见解，但它们的使用受到可用性有限和伦理问题的限制。猪被人类 HAV 毒株成功感染后，感染动物的肝脏中观察到炎症细胞浸润，而对照组则没有，其免疫反应总体上与人类和灵长类动物相似。此外，最近在包括海豹、蝙蝠、啮齿动物、刺猬、鸭子和土拨鼠等动物中发现的各种 HAV 毒株，可能会拓宽 HAV 研究可用的动物模型范围。

在可用于 HAV 免疫研究的小动物中，野生型小鼠在不敲除 MAVS 或 IFNAR1 的情况下对 HAV 不易感，这强调了 HAV 引发的免疫反应的相关性和强度，其与人类的病毒清除直接相关。在具有功能性适应性免疫反应且能有效清除感染（如 HAV 感染）的动物实验中，关于固有免疫反应的作用仍有许多问题未得到解答。具体来说，在 MAVS/IFNAR1 KO 小鼠中，HAV 感染据报道会持续存在，这凸显了我们对固有免疫反应理解的不足。在这方面，人源化肝脏嵌合小鼠的开发至关重要。这些小鼠在白蛋白启动子的控制下表达多种有害基因，导致小鼠肝细胞降解和坏死，从而允许 PHH 重新植入。人源化肝脏嵌合小鼠缺乏主要的专业适应性免疫细胞，支持人类嗜肝病毒的感染，为研究提供了有价值的模型。最近的一项研究利用该模型研究了 HAV 感染后的固有免疫反应，发现 3C 病毒抗原的表达与感染的人肝细胞中 III 型 IFN、多种 ISGs 和趋化因子的诱导相关，这表明感染细胞能够成功感知 HAV dsRNA，同时也反驳了 HAV 具有强大且消除性反击策略的观点。这种由 HAV 触发的细胞内在固有免疫反应可能会导致专业免疫细胞的募集，并最终有助于建立清除机制。

HAV 感染中的病毒特异性 T 细胞反应

早期研究探索了 HAV 特异性 CD8⁺ T 细胞在 AHA 中的作用。Vallbracht 等人描述了 HAV 感染患者血液和肝脏中释放 IFN - γ 的淋巴细胞，这些淋巴细胞能够裂解与 HLA - I 类匹配的 HAV 感染成纤维细胞，但不能裂解 HLA - I 类不匹配的成纤维细胞，或未感染或感染其他病毒的匹配成纤维细胞。此后，研究抗原特异性 T 细胞的先进方法不断发展，使得近期研究能够直接在体外对 HAV 特异性 T 细胞进行表征。

Schulte 等人首次报道了 HAV 特异性 CD8⁺ T 细胞表位。他们利用表位预测工具鉴定出与 HLA - A2 结合的表位，并使用表位肽刺激 HAV 感染患者的外周血单个核细胞（PBMCs）。在 HAV 的 3D 蛋白中发现一个在不同 HAV 基因型中高度保守的显性肽后，他们用其合成了 HLA - A2 四聚体，并使用该四聚体对 HAV 感染患者的 HAV 特异性 CD8⁺ T 细胞进行表征，发现这些细胞在感染早期被激活，在感染后阶段表现出记忆表型。

在黑猩猩模型中，Zhou 等人深入研究了 HAV 特异性 CD8⁺和 CD4⁺ T 细胞相对于病毒滴度和肝酶变化的特征性变化。他们发现，在病毒滴度和肝炎症状减轻后，HAV 特异性四聚体 CD8⁺ T 细胞的比例最高，但此时只有约 20% 的细胞在 MHC I 类表位刺激下分泌 IFN - γ 或 TNF。当病毒滴度持续存在时，四聚体 CD8⁺ T 细胞的频率急剧下降。相比之下，通过混合 MHC II 类表位刺激鉴定的 HAV 特异性 CD4⁺ T 细胞，在病毒滴度开始下降时分泌多种细胞因子，功能性 CD4⁺ T 细胞的比例随着粪便 RNA 的短暂回升而增加，并随着病毒载量的降低逐渐减少，这些发现表明 CD4⁺ T 细胞可能在病毒清除中直接或间接发挥重要作用。

Misumi 等人使用 Ifnar1^-/-小鼠感染模型，揭示了 CD8⁺ T 细胞在 HAV 清除中起重要作用。用四聚体定义的 HAV 特异性 CD8⁺ T 细胞与 HAV 病毒滴度和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平呈负相关，而用四聚体定义的 HAV 特异性 CD4⁺ T 细胞则无此相关性。在 T 细胞耗竭实验中，CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞的耗竭均导致病毒滴度增加和肝炎恶化，但当用肽疫苗刺激这些细胞群体时，只有 CD8⁺ T 细胞数量的增加能改善病情，不过仍需要使用免疫功能正常的模型进一步研究确定哪种 HAV 特异性 T 细胞群体对 HAV 清除至关重要。

HAV 感染中病毒非特异性 IL - 15 诱导的 T 细胞激活

AHA 大多为自限性疾病，但有时会导致暴发性肝衰竭，需要进行肝移植。与儿童相比，成年人初次感染 HAV 时更易出现严重肝损伤。由于 HAV 是非细胞病变性的，因此推测肝损伤是由宿主免疫引起的，但长期以来，免疫反应如何导致成年 AHA 患者肝损伤一直不清楚。

最近的一系列研究为这个问题提供了可能的答案。使用 H<