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本文聚焦霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的 Cascade–TniQ 复合物。该复合物中 Cas8 蛋白构象变化对 DNA 结合至关重要，但机制不明。研究通过结构建模和模拟，揭示其构象转变过程及 Cas7.1 的关键作用，为理解核酸结合和转座机制提供重要依据，极具科研价值。
### 研究背景
DNA 转座作为基因组中基因 “跳跃” 的基本过程，与特定 CRISPR 系统存在功能关联。细菌进化出 RNA 引导的可编程机制，借助 CRISPR–Cas 蛋白引导转座酶活性，实现基因在特定位点的 “敲入” ，为基因组编辑带来新契机。
CRISPR–Cas 系统利用引导 RNA 识别并切割互补 DNA 序列。在识别目标后，复合物发生构象和动态重排，形成 R 环结构（由 RNA:DNA 异源双链和一条单链 DNA 组成的三链核酸结构）。在此过程中，目标链（TS）与引导 RNA 互补配对，非目标链（NTS）被置换，为后续切割步骤做准备。但传统 CRISPR–Cas 系统在基因插入方面存在挑战，细菌进化出缺乏切割能力的 CRISPR–Cas 变体，即 CRISPR 相关转座子（CASTs），可招募关键转座蛋白进行位点特异性 DNA 转座。
霍乱弧菌中的 Tn7 样转座子编码 1F3-a 型 CRISPR–Cas 系统（Cascade），它与转座蛋白 TniQ 的同二聚体形成 Cascade–TniQ 复合物。该复合物会搜索目标 DNA，形成动态 R 环，并在其他蛋白的辅助下招募转座子进行 DNA 整合。R 环形成是这一复杂转座机制的关键调控点，但其具体机制和动态调控尚不清楚。同时，Cascade–TniQ 复合物结构研究发现，Cas8 亚基的一个关键结构元件 —— 由 278 - 388 位残基组成的螺旋束（Cas8 束），在 R 环形成过程中无法通过冷冻电镜（cryo-EM）成像建模，其在不同阶段的构象变化及作用有待探究。
研究方法
- 结构建模：结合 AlphaFold2 和 PyRosetta 进行结构建模。AlphaFold2 基于生物物理知识和多序列比对预测 Cas8 的三维结构，PyRosetta 则在保留实验结构位置的基础上，添加缺失的环和 Cas8 束模型。利用 MD 柔性拟合（MDFF）方法，将计算模型拟合到实验密度中，优化 Cas8 束在冷冻电镜密度图中的位置。
- 分子动力学模拟（MD 模拟）：采用适用于蛋白质 / 核酸复合物的 MD 模拟协议，使用 Amber ff19SB 力场，并结合 OL15 和 OL3 分别对 DNA 和 RNA 进行修正，TIP3P 模型用于水分子，积分时间步长设为 2 fs。运用 MDFF 方法，分阶段对 RNA 和 DNA 结合状态下 Cas8 束呈封闭构象的模型进行拟合，通过评估均方根偏差（RMSD）和交叉相关系数判断收敛性。
- 自由能模拟：运用伞形采样（US）方法进行自由能模拟，以描述 Cas8 束封闭态和开放态之间的构象转变并计算相关能量。将 Cas8 束骨干原子位置相对于封闭态和开放态的 RMSD 差值作为反应坐标（RC），将 RC 离散化为 0.5 ? RMSD 的增量，每个窗口模拟约 60 ns，共产生约 1.8 μs 的累积系综。使用变分自由能微扰（vFEP）方法计算平均力势（PMF）轮廓，并通过自展分析估计误差。
- 引入 “流动指数（FI）”：用于评估 Cas8 束与 Cas7.2 发夹环之间的相互作用对自由能轮廓的贡献。FI 综合了线性相互作用能（LIE，包括静电和范德华能）和两个感兴趣区域（Cas8 的 278 - 388 位残基与 Cas7.2 的 48 - 63 位和 228 - 243 位残基）之间形成的接触数，通过归一化处理得到。
- 小波分析：对 RNA 结合系统中 Cas8 束开放 - 关闭转变过程中的 Cas8 及相邻亚基（Cas6 和 TniQ 的 Cα 原子）进行小波分析。将原子相对于参考结构的位移作为输入信号，通过连续小波变换（CWT）分解时间序列，识别长尺度（低频）和短尺度（高频）振动小波，以研究蛋白动态耦合。
研究结果
- Cas8 结合模式：结构建模确定了 Cas8 束的两种主要构象 —— 封闭态和开放态。开放态与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）1F 型 Cascade 中观察到的取向相似，封闭态与实验中观察到的弱电子密度相符，且 AlphaFold2 模型对两种状态的预测均有较高可信度。优化后的结构显示，Cas8 束的顶端部分与 Cas7.1 和 TniQ.2 蛋白结合，与实验数据一致，且与基于弱电子密度数据的聚丙氨酸模型相符。
- Cas8 束的构象变化：自由能模拟结果显示，在 RNA 结合状态下，Halpin-Healy 构建的系统（RNA-HH）中，Cas8 束被困在封闭态最小值，缺乏稳定的开放态；Jia 构建的系统（RNA-Jia）中，Cas8 束存在对应封闭态的最小值和通向完全开放态的扩散区域。在 DNA 结合状态下，Halpin-Healy 的复合物（DNA-HH，代表不完全 R 环状态）中，封闭态和开放态之间的能垒较高（约 10 kcal/mol）；Jia 的复合物（DNA-Jia，R 环已形成）中，两者能垒约为 5 kcal/mol。这表明随着 R 环形成，Cas8 束更容易进入开放态，支持了束的构象变化有助于 R 环形成的假设。
- Cas7.1 促进 RNA 结合复合物中 Cas8 束的构象变化：分析 Cas8 束在构象变化过程中的相互作用发现，其主要与 Cas7 亚基相互作用。在 Jia 的 RNA 结合系统中，Cas8 束主要与 Cas7.1 相互作用，而在 RNA-HH 系统中更倾向于与 Cas7.2 相互作用。Cas7.1 的一个 10 氨基酸环（51 - 60 位残基）在不同系统中与 Cas8 束的相互作用存在差异，在 RNA-Jia 系统中，当 Cas8 束处于封闭态时，该环与 Cas8 束结合，而在 RNA-HH 系统中无此相互作用。额外的自由能模拟表明，在 RNA 结合状态下，Cas7.1 与 Cas8 的相互作用有利于 Cas8 束的构象变化，因为当 Cas7.1 未结合时，Cas8 与 Cas7.2 的相互作用更强，会阻碍 Cas8 束向开放态转变；而 Cas7.1 结合时，可减少这种不利接触。
- 同步动力学强化 Cas7.1 的作用：小波分析显示，在 Jia 的 RNA 结合复合物中，当 Cas7.1 与 Cas8 结合时，随着 Cas8 束进入封闭态，系统从快速模式转变为慢速模式，Cas8 的动力学与 Cas6 和 TniQ 耦合；在 RNA-HH 系统中，Cas7.1 未结合，系统在小波尺度上呈现杂乱的模式，Cas8 束构象变化时，其动力学与相邻域解耦。这表明 Cas7.1 通过减少与 Cas7.2 的不利相互作用（焓效应），以及动态耦合 Cas8 与相邻亚基（Cas7.6 和 TniQ）的运动，促进了 Cas8 束的开放 - 关闭构象转变。
研究讨论
霍乱弧菌 Cascade–TniQ 复合物展示了 CRISPR 相关蛋白引导基因精确转座的新范式，但结构研究未解析动态的 Cas8 束。本研究通过结构建模和自由能方法，揭示了 Cas8 束的两种构象及转变过程。在 RNA 结合状态下，Cas8 与 Cas7.1 的相互作用促进其向开放态转变，减轻与 Cas7.2 的不利接触，并使 Cas8 与相邻亚基动态耦合，降低开放态能垒，为 DNA 结合做准备。在 DNA 结合状态下，随着 R 环形成，Cas8 束开放态更易达到，其富含的精氨酸和赖氨酸残基在开放态下溶剂暴露增加，便于与 DNA 相互作用，推动 R 环形成完成。
综合研究结果，提出 Cas8 束在核酸结合中的作用机制模型：在 RNA 结合状态下，Cas8 束与 Cas7.1 环的相互作用促使其向开放态转变；DNA 结合时，随着 DNA TS 与引导 RNA 匹配，开放态更易实现，开放的 Cas8 束有助于形成完整 R 环；若无 Cas8 - Cas7.1 相互作用，Cas8 束难以转变为开放态，抑制 R 环完全形成。
与其他 CRISPR–Cas 系统类似，Cascade–TniQ 系统中 DNA 结合与结合域的大构象变化相关，且不依赖 ATP 水解，而是通过柔性亚基的构象变化促进 R 环形成。为进一步验证研究结果，可开展生化实验，如定点突变 Cas8 束中带正电残基以评估对 DNA 结合的影响，研究 Cas7.1 环与 Cas8 相互作用变化对核酸结合的影响；单分子实验可用于表征 Cas8 束在 R 环形成不同阶段的构象变化；溶液 NMR，尤其是弛豫实验，可揭示孤立 Cas8 束的内在动力学及带正电残基的作用。将这些实验数据与 MD 模拟相结合，有望更深入理解 Cas8 在 Cascade–TniQ 复合物中的功能动态。
本研究描绘了 Cas8 蛋白中动态螺旋束在 R 环形成中的重要作用，为理解转座子编码的 Cascade–TniQ 生物物理机制提供了关键信息，也为进一步研究 Cas8 在 R 环形成中的作用奠定了基础，推动了对转座过程的认识。
