弓形虫摄取途径缺陷突变体的代谢适应性与营养摄取机制研究：对潜在治疗靶点探索的重要意义

本文通过对弓形虫（Toxoplasma gondii）摄取途径缺陷突变体研究，发现 Δcpl和 Δcrt突变体依赖多种代谢途径，摄取途径影响其代谢物水平和复制，为理解弓形虫代谢适应性和寻找治疗靶点提供关键依据，值得一读。

　　

引言

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生虫，可感染全球约 30% 的人口，能入侵大多数温血动物的有核细胞。它获取营养的方式多样，包括从宿主细胞中摄取、操控宿主细胞以及自身的从头合成途径。

在弓形虫的营养摄取途径中，通过营养孔蛋白（如 GRA17、GRA23、GRA47 和 GRA72）扩散摄取小的可溶性代谢物；通过未知机制摄取宿主衍生的脂质。此外，还有一种摄取途径备受关注，即利用分泌蛋白 GRA14，借助宿主的内体分选转运复合体（ESCRT），在寄生泡膜（PVM）处产生囊泡，摄取宿主胞质物质。这些囊泡经内体样区室运输到植物液泡样区室（PLVAC），在 PLVAC 中，组织蛋白酶 L（CPL）降解摄取的蛋白质，氯喹抗性转运蛋白（CRT）将消化产物转运到寄生虫胞质中。然而，尽管有研究表明该摄取途径有助于获取宿主胞质蛋白，但弓形虫利用此途径的具体原因仍不清楚，且破坏该途径对体外寄生虫适应性影响有限。

研究人员提出假设，在摄取途径缺失的情况下，弓形虫可能会通过上调生物合成途径或增加其他营养摄取系统的利用来补偿。为验证这一假设，研究人员开展了全基因组 CRISPR 介导的基因敲除筛选实验，旨在找出与野生型（WT）相比，在摄取缺陷突变体中更有助于提高适应性的基因，从而揭示弓形虫更广泛的代谢适应性和营养获取策略。

结果

1. 摄取突变体菌株的生成与验证：研究人员在 RHCas9 菌株背景下，通过转染靶向GRA14、CPL或CRT第一外显子的单链引导 RNA（sgRNA），成功生成了摄取突变体菌株 RHCas9Δgra14、RHCas9Δcpl和 RHCas9Δcrt。利用桑格测序和蛋白质免疫印迹技术，证实了基因的破坏情况；通过摄取实验，确认 RHCas9Δgra14寄生虫对宿主胞质蛋白的摄取减少。
2. CRISPR 筛选实验及数据分析：对 WT、Δgra14、Δcpl和 Δcrt菌株进行全基因组 CRISPR 筛选。实验流程包括将含有每个基因 10 个 sgRNA 的质粒文库转染到寄生虫中，经多次传代后提取基因组 DNA，对 sgRNA 进行 PCR 扩增和测序，并与初始文库比较。通过计算每个基因的表型得分（即从初始 sgRNA 池到最终群体中相对丰度的 log2 倍数变化），评估基因对寄生虫适应性的影响。虽然实验中出现了适度的瓶颈效应（最终文库缺失约 30%-60% 的 sgRNA），但 WT 筛选的表型得分与原始 CRISPR 筛选具有较高的相关性（R2 值为 0.85），且 WT 重复实验之间相关性高，表明实验具有可重复性。
3. 筛选结果及验证：经过计算表型得分，并通过与一组仅在寄生虫有性阶段表达的基因（作为可 dispensable 基因的参考队列）比较，确定基因表型得分的变化是否具有统计学意义。分析发现，Δgra14、Δcpl和 Δcrt突变体中分别有 149、307 和 845 个基因的表型得分显著降低，210、96 和 34 个基因的表型得分显著升高。在三个突变体中共同发现 30 个基因，这些基因在突变体中比 WT 更有助于提高适应性。

为验证这些基因是否为真正的 “命中” 基因，研究人员选取了 6 个基因（TGGT1_308830、TGGT1_219190、TGGT1_254840、TGGT1_262640、TGGT1_279390 和 TGGT1_249270）进行验证实验。将靶向这些基因的 sgRNA 转染到 WT、Δgra14或 Δcpl寄生虫中，以靶向sag1和cdpk1的 sgRNA 作为阴性和阳性对照。实验结果显示，破坏这些被认为有助于提高适应性的基因，会降低 WT 和突变体的适应性，但部分基因的验证结果存在不确定性，如部分突变体的菌斑大小变化不显著，无法确定其是否为合成致死基因。4. 代谢途径分析：对具有重叠的显著基因的突变体对进行分析，发现 Δcpl和 Δcrt突变体之间的重叠最大，共有 201 个基因。通过代谢途径分析发现，这些重叠基因涉及嘧啶生物合成、脂肪酸（FA）生物合成、三羧酸（TCA）循环和赖氨酸降解等途径。这表明当 PLVAC 功能受损时，这些生物合成途径可能起到关键的补偿作用。然而，通过药物敏感性实验，并未证实 ΔcplnLuc 寄生虫对靶向这些代谢途径的药物（如氟乙酸钠、阿托伐醌和三氯生）更加敏感，其代谢组学特征是否受影响仍不明确。5. 代谢组学分析：对摄取突变体进行代谢组学分析。主成分分析显示，WT 和 WT - DMSO 样本聚集在一起，而 Δgra14、Δcpl、Δcrt和大多数 WT - LHVS 样本聚集在一起且远离 WT 样本，表明这些寄生虫发生了保守的变化。进一步分析发现，摄取突变体中糖酵解的中间产物和终产物减少，如丙酮酸在三个突变体中均显著减少，葡萄糖在 Δgra14和 Δcpl突变体中显著降低；戊糖磷酸途径（PPP）中的 6 - O - 磷酸 - D - 葡萄糖酸在所有摄取突变体中增加，同时 Δgra14寄生虫中的鸟苷、腺苷和胞苷水平显著降低，这表明摄取途径的破坏可能影响了核苷的补救合成途径。

此外，摄取突变体中大多数氨基酸水平显著降低，Δgra14突变体中除丙氨酸和缬氨酸外，所有氨基酸水平均显著降低，Δcpl和 Δcrt突变体的氨基酸水平变化较为复杂，但总体也呈现出与摄取途径相关的变化。尽管突变体中氨基酸减少，但与 WT 寄生虫相比，生长缺陷并不明显，说明寄生虫可能通过其他方式（如氨基酸转运体）获取足够的氨基酸。6. 营养限制条件下的生长实验：为评估摄取途径在营养限制条件下对氨基酸获取的贡献，研究人员在单氨基酸缺失的培养基中培养突变体。实验结果显示，在完全培养基中，WTnLuc、Δgra14nLuc、ΔcplnLuc 和 ΔcrtnLuc 寄生虫的倍增时间没有差异；但在色氨酸缺失的培养基中，ΔcplnLuc 和 ΔcrtnLuc 突变体的生长明显慢于 WTnLuc 寄生虫。在其他氨基酸（如苯丙氨酸、精氨酸和酪氨酸）限制的条件下，ΔcplnLuc 也表现出生长缓慢的现象。这表明在营养限制情况下，弓形虫可能依赖 PLVAC 中的物质周转来获取营养，摄取途径的破坏会影响其在营养匮乏时的资源摄取能力。

讨论

1. 研究成果总结：研究通过 CRISPR 筛选、代谢途径分析和代谢组学研究，深入探讨了弓形虫在摄取途径缺失时的适应性机制。尽管 CRISPR 筛选存在适度瓶颈，但与原始筛选结果相关性良好，且突变体之间的基因重叠具有统计学意义。代谢途径分析表明，Δcpl和 Δcrt突变体在 PLVAC 功能受损时，可能依赖嘧啶生物合成、FA 生物合成、TCA 循环和赖氨酸降解等途径进行补偿；代谢组学分析显示，摄取途径缺失会导致糖酵解中间产物和某些氨基酸显著减少，影响寄生虫的代谢。
2. 摄取途径对氨基酸获取的影响：详细的代谢组学分析支持了摄取途径对氨基酸获取有重要影响的假设。突变体中氨基酸水平的变化，尤其是 Δgra14突变体中氨基酸的普遍减少，表明摄取途径在从宿主胞质中获取关键营养物质（特别是氨基酸）方面发挥着作用。在营养限制条件下，PLVAC 突变体（如 ΔcplnLuc 和 ΔcrtnLuc）的生长受损，进一步证实了弓形虫在宿主营养匮乏时，可能利用 PLVAC 作为氨基酸周转的场所。
3. 摄取途径与其他营养获取方式的关系：在 Δcpl的 CRISPR 筛选中，发现两个已知的营养孔基因 GRA17 和 GRA72 更有助于提高适应性，这表明当 CPL 功能受损导致蛋白质周转受影响时，寄生虫可能更依赖可溶性营养物质，暗示寄生虫质膜上可能存在高亲和力转运蛋白，用于摄取 GRA17 获取的资源，这为研究 PLVAC 的物质周转提供了新的视角。
4. 摄取途径对核苷获取的潜在作用：研究还发现，摄取途径缺失的突变体中核苷减少，且更依赖嘧啶生物合成，这表明摄取途径可能参与宿主胞质核苷的摄取，推测可能以宿主 rRNA、mRNA 和 tRNA 的形式获取。近期研究发现，平衡核苷转运蛋白 TgENT1 定位于 PLVAC，该转运蛋白对寄生虫至关重要，可能在摄取途径获取的宿主核苷释放过程中发挥作用。
5. 研究的局限性：本研究存在一定局限性，未能直接验证任何重叠的 “命中” 基因是否为合成致死基因。在 30 个在所有三个摄取缺陷突变体中均有助于提高适应性的基因中，只有 9 个基因的 WT 表型得分表明它们在 WT 寄生虫中可能是可缺失的，但部分基因在先前研究中的表型得分与本研究存在差异，这凸显了表型得分存在一定的不确定性。此外，研究采用的验证方法（如菌斑实验）与 CRISPR 筛选的竞争实验在衡量适应性方面存在差异，未来应考虑采用替代方法（如成对竞争实验）进行验证。
6. 研究意义及展望：本研究揭示了弓形虫在营养摄取方面的适应性和代谢灵活性，强调了弓形虫依赖多种适应性途径来补偿营养损失的特点，这对于理解其作为细胞内病原体的进化成功具有重要意义。未来的研究可以进一步深入探讨摄取途径与其他营养获取途径之间的相互作用，以及如何利用这些发现开发针对弓形虫感染的新型治疗策略。

材料和方法

1. 宿主细胞和细胞培养：人包皮成纤维细胞（HFFs）在含有特定成分的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，弓形虫菌株在 HFFs 中传代培养。
2. 寄生虫菌株的生成：通过转染靶向特定基因的质粒，并进行筛选和验证，生成多种弓形虫突变体菌株，如 RHCas9Δgra14、RHCas9Δcpl、RHCas9Δcrt、RHΔku80nLucΔgra14和 RHΔku80nLucΔcrt等。
3. 摄取实验：利用诱导表达 mCherry 的 HeLa 细胞和荧光显微镜，对寄生虫摄取宿主胞质蛋白的情况进行检测和分析。
4. 免疫印迹：使用特定的抗体和免疫印迹技术，验证寄生虫中蛋白质的破坏情况。
5. CRISPR 筛选：采用含有每个基因 10 个 sgRNA 的文库，对弓形虫进行全基因组 CRISPR 筛选，经过转染、传代、DNA 提取、PCR 扩增和测序等步骤，分析基因对寄生虫适应性的影响。
6. 数据分析：通过定制的 KNIME 工作流程和特定的 R 脚本，对测序数据进行处理和分析，计算基因的表型得分，并通过统计检验确定显著变化的基因。
7. 基因富集分析：利用 ToxoDB 的代谢途径富集分析工具，对显著变化的基因进行基因富集分析。
8. 筛选验证：选取部分在突变体中有助于提高适应性的基因，通过转染 sgRNA 破坏基因，进行菌斑实验和基因敲除验证，评估基因对寄生虫适应性的影响。
9. 荧光素酶生长实验：通过荧光素酶生长实验，检测寄生虫在药物处理或营养限制条件下的生长情况，计算半数抑制浓度（IC₅₀）或倍增时间。
10. 代谢组学：对感染弓形虫的 HFF 单层细胞进行处理，收集寄生虫进行代谢组学分析，采用液相色谱 - 串联质谱技术检测代谢物，并通过数据分析比较 WT 和摄取突变体之间的代谢物差异。