纳米抗体助力非洲猪瘟病毒 K205R 蛋白抗原表位解析及其在防控中的关键意义

非洲猪瘟（ASF）严重威胁养猪业，尚无有效防控策略。本文利用纳米抗体（Nbs）鉴定出 ASFV 的 K205R 蛋白两个线性 B 细胞表位1MVEPR5和188RTQF191，其中188RTQF191为首次报道。这些发现为 ASFV 诊断和疫苗开发提供重要依据。

　　### 引言
非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、高度传染性和致命性传染病，给全球养猪业带来巨大威胁。ASFV 是 Asfarviridae 科 Asfivirus 属的唯一成员，其基因组庞大复杂，编码多种蛋白，但多数蛋白功能尚不清楚。

K205R 是 ASFV 的一种非结构蛋白，具有良好的免疫原性，在病毒感染早期表达，能引发猪的强烈免疫反应，是潜在的早期血清诊断抗原。然而，其在免疫保护中的具体作用以及优势保守表位仍有待明确。

纳米抗体（Nanobodies，Nbs）源自骆驼科动物重链抗体可变区（VHH），具有独特结构和优势。在前期研究中，已筛选出针对 K205R 蛋白的 5 种 Nbs，本研究以此为工具，探索 K205R 蛋白的抗原表位，为抗 ASFV 药物或诊断试剂的开发提供理论基础。

材料和方法

1. 细胞和血清：实验选用人胚肾 293T（HEK293T）细胞、Vero 细胞、猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages，PAMs），并使用实验室保存的 5 份 ASFV 抗体阳性血清和从 ASF 净化猪场采集的 5 份 ASFV 抗体阴性血清。
2. Nbs-HRP 融合蛋白的制备：将筛选出的针对 K205R 蛋白的 Nbs（K205R-Nb1、K205R-Nb14、K205R-Nb35、K205R-Nb82）与辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）构建融合蛋白。通过将分泌信号序列、Nbs 和 HRP 插入 pCAGGS-HA 载体，转染 HEK293T 细胞，收获细胞上清获得 Nbs-HRP 融合蛋白，并采用 ELISA、蛋白质免疫印迹（Western blotting）和间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay，IFA）评估其表达和分泌情况。
3. Nbs-His 与 ASFV-K205R 蛋白结合亲和力测定：采用 ELISA 法，将 K205R 蛋白包被于 96 孔板，加入不同浓度的 Nbs-His 蛋白，依次孵育小鼠抗骆驼多克隆抗体、HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG，最后加入四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）显色，测定吸光度，评估结合能力。
4. 免疫过氧化物酶单层试验（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）：Vero 细胞接种 ASFV HLJ/18 株后固定，分别加入不同稀释度的 Nbs-HRP 融合蛋白作为一抗，同时设置 ASFV 抗体阳性血清和阴性血清作为对照，孵育后加入 HRP 标记的山羊抗猪 IgG，再加入 3 - 氨基 - 9 - 乙基咔唑（3-amino-9-ethylcazole，AEC）染色，显微镜下观察。
5. 重组 ASFV K205R 蛋白的真核表达与鉴定：从 pET-30a-K205R 模板扩增 K205R 基因，插入 pCAGGS-HA 真核表达载体，转染 HEK293T 细胞，通过 Western blotting 和 IFA 检测 K205R 蛋白的表达。
6. 不同截短 ASFV K205R 和 Nbs-His 蛋白的表达与纯化：设计并表达多种截短的 K205R 蛋白，部分在大肠杆菌中表达，部分在真核系统中表达。同时，在原核系统中表达和纯化 4 种 Nbs，用于后续实验。
7. Western blotting：收集 HEK293T 细胞，裂解后进行 12.5% SDS-PAGE 电泳，转膜至聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，封闭后分别与 Nbs-HRP 融合蛋白或其他一抗孵育，再与 HRP 标记的二抗孵育，最后用 ECL 底物显色，化学发光成像系统采集信号。
8. IFA：将 HEK293T 细胞或 PAMs 接种于 24 孔板，转染或感染相应病毒后固定、封闭，依次加入 Nbs-HRP 融合蛋白、小鼠抗 HA 抗体、Alexa Fluor 594 标记的山羊抗小鼠 IgG [H&L]，最后用 4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，荧光显微镜下观察。
9. ELISA：包括直接 ELISA 检测 Nbs-HRP 融合蛋白的表达，以及间接 ELISA（Indirect ELISA，iELISA）检测 K205R 肽与 ASFV 阳性血清的反应。
10. 斑点印迹（Dot blot）和基于肽的 ELISA：将肽点样于硝酸纤维素膜，封闭后与一抗孵育，ECL 底物显色；在基于肽的 ELISA 中，将 K205R 肽包被于 96 孔板，与 Nbs-HRP 融合蛋白孵育，TMB 显色后测定吸光度。
11. K205R 肽与 Nb 的分子对接：利用 SWISS-MODEL 在线服务器对 4 种 Nbs 进行同源建模，生成三维结构。对表位进行质子化和三维扩展，使用 AutoDock Tools 和 AutoDock Vina 进行分子对接，最后用 PyMOL 分析相互作用。
12. 统计分析：所有实验至少独立重复 3 次，两组间比较采用 Student's t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA），P<0.05 为差异具有统计学意义。

结果

1. Nbs-HRP 融合蛋白的制备：IFA、Western blotting 和直接 ELISA 结果表明，成功在 HEK293T 细胞中表达和分泌了 Nbs-HRP 融合蛋白，且表达量呈剂量依赖性。
2. Nb1、Nb14、Nb35 和 Nb82 与 ASFV-K205R 蛋白的反应性：SDS-PAGE 分析证实重组 ASFV-K205R 蛋白成功表达且纯度高。Western blotting 和直接 ELISA 结果显示，这 4 种 Nbs 能特异性识别 K205R 蛋白的线性表位，与 ASFV-DP96R 蛋白无反应。ELISA 分析不同稀释度 Nbs-HRP 融合蛋白的亲和力发现，Nb1、Nb35 和 Nb82-HRP 融合蛋白在 1:100 稀释时吸光度值超过 1.0，Nb14-HRP 亲和力相对较低。同时，4 种 Nbs 与真核表达的 K205R 蛋白也具有结合能力。
3. Nbs-HRP 与 ASFV 感染细胞的反应性：IFA 和 IPMA 结果表明，Nb1、Nb14、Nb35 和 Nb82-HRP 能识别 ASFV 感染的 PAMs 和 Vero 细胞，而对照上清无反应，证实了这 4 种 Nbs 对 ASFV 感染细胞的识别能力。
4. ASFV-K205R-Nb1、Nb14、Nb35 和 Nb82 识别的表位鉴定：通过原核表达不同截短的 K205R 蛋白，结合 Western blotting 和直接 ELISA 分析，确定 K205R-Nb1、Nb14 和 Nb82 结合 K205R 蛋白的 1-34 氨基酸区域，Nb35 结合 139-206 氨基酸区域。
5. ASFV-K205R-Nb1、Nb14 和 Nb82 的核心结合位点：合成 K205R 1-34 氨基酸区域的系列截短肽，经斑点印迹和基于肽的 ELISA 验证，确定 Nb1、Nb14 和 Nb82 靶向的核心 B 细胞表位为¹MVEPR⁵。
6. ASFV-K205R-Nb35 的核心结合位点：在真核系统中表达不同截短的 K205R 蛋白，结合 Western blotting 和 IFA 分析，确定 Nb35 识别的核心 B 细胞表位为¹⁸⁸RTQF¹⁹¹。
7. 鉴定的线性 B 细胞表位与灭活 ASFV 阳性血清的反应性：以¹MVEPR⁵和¹⁸⁸RTQF¹⁹¹为包被抗原，肽基 ELISA 检测发现，它们能与 5 份灭活的 ASFV 阳性猪血清发生强烈反应，与阴性血清无反应，表明这两个表位是天然线性 B 细胞表位。
8. ASFV 流行分离株中 NTD 抗原区域的保守性分析：利用 DNASTAR Protean 软件分析，发现¹MVEPR⁵位于 K205R 蛋白 N 端，¹⁸⁸RTQF¹⁹¹位于 C 端，两者均具有较高抗原指数且分布在蛋白表面，且在不同基因型的 ASFV 菌株中高度保守。
9. K205R 肽与 Nb 的复合对接：分子对接结果显示，Nbs 与相应表位之间存在多种相互作用，计算得到的结合能表明它们具有良好的结合性能。

讨论

ASF 具有高传染性、高感染率和发病迅速的特点，目前缺乏有效防控措施，疫苗是防控传染病的最有效策略。B 细胞表位在诱导免疫反应中起关键作用，鉴定新表位对开发诊断工具、疫苗和治疗性抗体至关重要。

K205R 蛋白是 ASFV 的主要抗原之一，在病毒感染早期表达，对 ASFV 早期诊断具有重要意义，且在抗体检测方面具有优势。然而，ASFV 复杂，疫苗开发面临挑战，探索其蛋白功能有助于疫苗研发。

本研究利用 Nbs 鉴定出 K205R 蛋白的两个表位¹MVEPR⁵和¹⁸⁸RTQF¹⁹¹，其中¹⁸⁸RTQF¹⁹¹为首次报道，¹MVEPR⁵的准确性也得到进一步提升。这两个表位在不同基因型的 ASFV 菌株中高度保守，且能与灭活的 ASFV 阳性血清反应，表明它们是天然线性 B 细胞表位。特定的 Nbs 和基于 Nbs 的诊断方法将为 ASF 的防控提供重要工具。