利用高分辨率质谱对鲤疱疹病毒 2 型进行蛋白质基因组分析：拓展认知，助力水产病毒学研究

《Journal of Virology 4.0》：Proteogenomic analysis of Cyprinid herpesvirus 2 using high-resolution mass spectrometry

《利用高分辨率质谱对鲤疱疹病毒 2 型进行蛋白质基因组分析》一文，运用多种蛋白质提取与分离方法，结合蛋白质基因组分析，对鲤疱疹病毒 2 型（CyHV-2）基因组重新注释，鉴定出 12 个新基因，为研究 CyHV-2 基因组结构和生物学特性提供新视角，值得关注。

　　### 引言
鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesviruses）属于鲤病毒属（Cyprinivirus）、异疱疹病毒科（Alloherpesviridae），是一类线性双链 DNA 病毒 ，其中鲤疱疹病毒 2 型（CyHV-2）专门感染鲫鱼或金鱼（Carassius auratus），引发疱疹病毒性造血坏死病（HVHND） 。1992 - 1993 年，HVHND 首次在日本幼金鱼中被记录，此后在全球多地出现，给水产养殖业造成重大经济损失。2012 年，中国首次在观赏金鱼中检测到 CyHV-2，此后该病几乎每年都有报道。

2013 年，首个 CyHV-2 完整基因组（ST-J1 株）被测序，其包含 290,304 bp，编码 150 个推定的开放阅读框（ORFs） 。目前已有 7 个 CyHV-2 菌株基因组被完全测序，所有菌株基因组序列同源性超 98% 。通过比较基因组学分析，CyHV-2 菌株可分为中国（C）和日本（J）基因型，ST-J1 株属于 J 基因型，其余为 C 基因型 。不同基因型菌株存在诸多突变，一些基因变异可作为区分基因型和中国不同分离株的潜在分子遗传标记 。

虽然已知 CyHV-2 基因组中 150 个预测的 ORFs 会按转录数据顺序表达，并可分为即刻早期、早期和晚期基因，但目前只有 74 个 ORFs 编码的蛋白被视为病毒结构蛋白 。而且，CyHV-2 最初的 ORF 预测是基于生物信息学工具，部分注释的 ORFs 可能不编码功能蛋白，也可能遗漏了一些功能蛋白编码 ORF，其基因组注释准确性有待提高。蛋白质基因组映射是改进基因组注释的有效策略，但当前自下而上的蛋白质组学策略在检测低分子量、低表达和跨膜结构蛋白时存在挑战。本研究旨在利用多种蛋白质提取和分离方法，结合蛋白质基因组分析，改进 CyHV-2 基因组注释，为深入了解其基因组结构和生物学特性提供依据。

材料与方法

1. 蛋白质提取：选取健康鲫鱼（平均体重 150 ± 50 g），腹腔注射 200 μL CyHV-2 YC2022 株（1 × 10⁶ copies/μL），5 天后用 PCR 检测鱼体内 CyHV-2 的存在 。取肾脏组织，用两种不同裂解缓冲液提取蛋白质。一种是 50 mM HCl、0.5% 二硫苏糖醇（DTT）和 0.1% N - 十二烷基 -β-D - 麦芽糖苷（DDM）；另一种是 20 mM Tris-HCl（pH = 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% DDM 和 1× Roche 蛋白酶与磷酸酶抑制剂鸡尾酒 。样品经匀浆、冰上超声 5 分钟、12,000 g 4℃离心 10 分钟去除细胞碎片或酸变性沉淀蛋白。第一种方法提取的上清液用 10 kDa 超滤装置过滤去除高分子量蛋白，低温蒸发至干；第二种方法提取的上清液用五倍体积预冷丙酮在 - 20℃沉淀过夜，再用等体积预冷甲醇洗涤，最后用 BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。
2. 胰蛋白酶消化：将两种裂解缓冲液得到的蛋白沉淀溶解于 6 M 尿素，加入 10 mM DTT 在 37℃还原 40 分钟，再用 15 mM 碘乙酰胺在 37℃避光烷基化 30 分钟 。用 50 mM NH₄HCO₃稀释样品至尿素终浓度为 1 M，按 1:50（wt/wt）加入胰蛋白酶（Promega），37℃孵育 12 小时进行蛋白质消化。
3. 高 pH 反相分离：采用 C18 柱（Agilent Technologies）对所有肽段进行分离 。将胰蛋白酶消化后的肽段溶解在 25 mM NH₄FA（pH = 10）中，上样到平衡好的 C18 柱上，用含不同浓度乙腈（ACN，5%、10%、20%、30%、40% 和 75%）的 25 mM NH₄FA（pH = 10）洗脱缓冲液进行洗脱 。收集所有洗脱组分，冻干后用 0.1% 甲酸复溶，用于 LC-MS/MS 分析。
4. 质谱数据采集：使用配备 EASY-nLC 1200 系统的 Q-Exactive Plus 质谱仪分析肽段 。肽段通过 C18 纳米捕集柱（Acclaim PepMap C18；75 μm × 25 cm，2 μm，100 ?，Thermo Scientific）分离，流速为 300 nL/min，在 120 分钟内从 5% 溶剂 B（100% ACN/0.1% 甲酸，vol/vol）到 80% 溶剂 B 进行线性梯度洗脱 。肽段通过纳米电喷雾电离在 2.2 kV 下电离，采用数据依赖采集（DDA）模式，在 Orbitrap 中进行 350 - 2,000 m/z 的全扫描，分辨率为 70,000（@200 m/z） 。MS/MS 扫描的隔离宽度为 1.8 m/z，AGC 目标为 5 × 10⁴，分辨率为 17,500，最大离子注入时间为 50 ms，归一化 HCD 碰撞能量为 28%，每个循环进行 20 次 MS/MS 扫描，动态排除时间设置为 40 秒。
5. 序列数据库开发和肽段鉴定：利用 Proteome Discoverer 2.4 和 pFind 3.2 分析所有 RAW 数据文件，搜索自定义蛋白质数据库 。该数据库包含鲫鱼蛋白质组和 CyHV-2 YZ-01 株全基因组序列的六框翻译结果，由 ORFfinder 软件生成 。检索数据的标准设定为：MS1 质量容差为 10 ppm，MS2 质量容差为 0.02 Da；错误发现率为 1%；胰蛋白酶为裂解酶，允许最多 2 个漏切位点；半胱氨酸的氨甲酰甲基化修饰设为固定修饰；可变修饰包括甲硫氨酸氧化、蛋白质 N 端乙酰化以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化修饰 。将两个不同搜索引擎鉴定的肽段手动合并，使用 UniProt 中的肽段搜索工具映射到预测的 CyHV-2 蛋白质数据库和鲫鱼蛋白质组 。记录与预测的 CyHV-2 蛋白质数据库完全匹配且与鲫鱼蛋白质组不匹配的肽段的基因组映射信息，用于后续分析，并用 TBtools 软件可视化蛋白质基因组映射结果。
6. 实时荧光定量 PCR 分析：使用 FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit（Vazyme）从感染 CyHV-2 的鱼肾脏中提取总 RNA，按照 HiScript III First-Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）说明书将其逆转录为 cDNA 。根据新基因编码区设计正向和反向引物，引物序列列于相关表格。
7. 质粒构建、转染和共聚焦成像：以病毒 cDNA 文库为模板，PCR 扩增 nORF1 全长序列，克隆到质粒 pEGFP-N1 的XhoI-PstI位点 。测序验证后，用 endo-free plasmid Midi Kit（Omega）提取质粒 。将质粒转染到银鲫（GiCB）脑细胞系中，使用 Takara 试剂盒按照说明书操作 。转染后的 GiCB 细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）的 Hyclone Medium 199（Hyclone）中，28℃培养 。转染 24 小时后，用 PBS 洗涤细胞 3 次去除培养基，4% 多聚甲醛固定 20 分钟，然后用 DAPI（1 μg/mL）和 Dil（5 μM）试剂分别对细胞核和细胞膜染色，最后用 Olympus 共聚焦显微镜观察转染细胞。

结果

1. CyHV-2 基因组注释的综合蛋白质基因组工作流程：采用基于 LC-MS/MS 的自下而上蛋白质组学方法研究 CyHV-2 表达的蛋白质组 。为促进病毒蛋白鉴定和序列覆盖，使用 50 mM HCl 和 Tris-HCl（pH = 7.5）缓冲液提高蛋白质提取效率，尤其是对短开放阅读框（sORFs）的富集 。HCl 缓冲液可促进高分子量（MW）蛋白沉淀，增强 sORF 富集 。用 10 kDa 超滤装置过滤 HCl 裂解物以进一步去除高分子量蛋白，将总蛋白和分离的 sORFs 用胰蛋白酶消化 。两组肽段混合物经高 pH 反相柱分离以降低样品复杂性，然后进行质谱分析。为最大化质谱图谱解析，使用 Proteome Discoverer 和 Open-pFind 两个不同搜索引擎搜索自定义蛋白质数据库，并应用严格的过滤阈值（FDR ≤ 1%） 。自定义蛋白质数据库由鲫鱼蛋白质组和 CyHV-2 YZ-01 株全基因组六框翻译序列组合而成 。选择 YZ-01 株基因组序列是因为本研究中分离的 YC2022 株与 YZ-01 株基于 8 个高变基因序列构建的系统发育树显示出更高的序列相似性 。去除可匹配鲫鱼基因组以及同时匹配宿主和病毒基因组的肽段后，剩余的独特肽段用于重新注释 CyHV-2 基因组并发现潜在新 ORFs。
2. 基于 MS 数据的 CyHV-2 蛋白质组草图：结合 Proteome Discoverer 和 Open-pFind 的检索结果，共得到 1,683 个基于六框翻译完全匹配 CyHV-2 YZ-01 基因组编码肽段的 MS/MS 谱图，用于 CyHV-2 基因组重新注释 。HCl 提取法鉴定出 912 个 MS/MS 谱图，Tris 提取法鉴定出 1,328 个 MS/MS 谱图，其中 557 个 MS/MS 谱图两种方法都能鉴定到 。排除与病毒基因组和鲫鱼基因组都匹配的 MS/MS 谱图后进行分析 。蛋白质基因组映射结果显示，蛋白质在 CyHV-2 基因组的大部分区域都有表达，中央区域的基因表达频率明显高于基因组两端 。在所有鉴定的 MS/MS 谱图中，1,665 个映射到 CyHV-2 当前注释的蛋白质编码 ORFs（指 ST-J1 和 YZ-01 株的基因组注释），对应 117 个已知蛋白质 。其余 18 个 MS/MS 谱图映射到当前无注释的病毒基因组区域，其中 3 个位于当前注释蛋白质的 N 端延伸区域，9 个位于基于六框翻译的蛋白质编码区域，6 个属于新鉴定的 ORFs 。根据基因组定位，这 18 个新鉴定的肽段可进一步分为基因间（7 个肽段位于注释基因模型之间）或基因内（11 个肽段在注释基因模型内或附近） 。排除位于 N 端延伸区域的 3 个肽段，其余 15 个新肽段构成 12 个潜在新 ORFs，命名为 nORF1 - 12。

基于生物信息学分析，CyHV-2 YZ-01 基因组预测编码 148 个基因 。本研究 MS 结果和先前结构蛋白研究共鉴定出 121 个基因编码的蛋白质，而在本数据集未鉴定到 4 个结构蛋白（ORF19、ORF44、ORF70 和 ORF83） 。同时，还有 27 个预测的 ORFs 缺乏蛋白质水平的证据支持 。此外，发现 CyHV-2 当前已知的 ORFs 主要来自规范（ATG）起始密码子注释，可能遗漏了非规范（非 ATG）起始密码子的 ORFs 。新鉴定的对应 8 个 nORFs 和 3 个注释修订的 ORFs 的肽段具有非 ATG 起始密码子，如 TTG 和 CTG。
3. 新肽段与周围可行 ORFs 的验证：为验证 12 个 nORFs 注释的准确性，手动检查发现除一个肽段外，几乎所有新肽段都唯一匹配相应的蛋白质编码区域，且都有丰富的 b/y 离子系列支持 。通过 RT-PCR 检测 12 个 nORFs 的 RNA 转录本，发现除 nORF2 和 nORF3 外，大多数在病毒增殖过程中表达 。以未逆转录的总 mRNA 为模板进行 PCR 扩增作为阴性对照，排除潜在的基因组 DNA 污染 。利用在线 InterPro 工具和 BLASTP 模块分析 12 个 nORFs 的结构域及其在相关物种中的潜在同源物 。结构域分析结果表明，4 个 nORFs 包含已知结构域，如信号肽和跨膜区域；3 个 nORFs 预测具有内在无序结构域，其余未鉴定到明确的结构特征 。值得注意的是，nORF8 和 nORF9 分别包含信号肽序列和非细胞质结构域（细胞外区域），表明它们可能是分泌蛋白 。nORF8 和 nORF9 的编码区域位于预测的保守蛋白激酶 ORF104 的蛋白质编码序列内 。蛋白质同源性分析显示，小蛋白 nORF2（15 个氨基酸）与参与肌肉运动的昆虫蛋白 titin 有序列相似性 。这些分析支持预测的 nORFs 在 CyHV-2 基因组中的存在。
4. CyHV-2 肽段中磷酸化修饰的鉴定：在先前研究中对感染 CyHV-2 的鲫鱼进行磷酸化蛋白质组分析，经固定化钛离子亲和色谱（Ti⁴⁺-IMA<